加味西黃軟膠囊中膽酸、麝香酮的含量測定

金 芬， 熊富良， 熊登科， 熊 莉， 向 陽

（1.湖北中醫(yī)學(xué)院，湖北武漢430061；2.武漢理工大學(xué)化工學(xué)院，湖北武漢430070；3.湖北省暨武漢市中藥現(xiàn)代化工程技術(shù)研究中心，湖北武漢 430052）

加味西黃軟膠囊中膽酸、麝香酮的含量測定

金 芬1， 熊富良2*， 熊登科3， 熊 莉3， 向 陽3

（1.湖北中醫(yī)學(xué)院，湖北武漢430061；2.武漢理工大學(xué)化工學(xué)院，湖北武漢430070；3.湖北省暨武漢市中藥現(xiàn)代化工程技術(shù)研究中心，湖北武漢 430052）

加味西黃軟膠囊；膽酸；麝香酮；含量測定

目的：建立反相高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測法（HPLC-ELSD）測定加味西黃軟膠囊（牛黃、麝香、蟾酥、乳香、沒藥）中膽酸的含量；建立氣相色譜法測定加味西黃軟膠囊中麝香酮的含量。方法：膽酸采用十八烷基鍵合硅膠色譜柱（Kromasil C18，5 μm，4.6 mm × 250 mm），流動相為甲醇 －0.1%冰醋酸（73∶27），流速：1.0 mL/min；ELSD檢測器參數(shù)：蒸發(fā)溫度40℃，載氣（N2）壓力200 kPa。麝香酮的含量測定以正十八烷為內(nèi)標(biāo)物，采用DB-1型毛細(xì)管色譜柱（30 m×0.32 mm×0.25 μm）；FID檢測器；程序升溫。結(jié)果：膽酸在45.2～904 ng范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，平均回收率為99.06%，RSD為1.56% 。麝香酮在0.05～0.5 mg/mL范圍內(nèi)與峰面積比值的線性關(guān)系良好，平均回收率為99.40%，RSD為0.95%。結(jié)論：本方法簡便、準(zhǔn)確，可用于該制劑的質(zhì)量評價。

加味西黃軟膠囊是由牛黃、麝香、蟾酥（制）、乳香（制）、沒藥（制）五味藥組成的復(fù)方中藥制劑，具有清熱解毒、活血化瘀、消毒散結(jié)、止痛等功效，臨床上用于癰疽疔毒、瘰疬、流注、癌腫等的治療。方中牛黃既為君藥又為貴重藥、麝香為貴重藥，因此建立了這兩味藥材的含量測定方法。膽酸為牛黃的有效成分之一，麝香酮為麝香的有效成分之一，本試驗(yàn)參考有關(guān)文獻(xiàn)［1］，通過大量試驗(yàn)建立了膽酸的反相高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測法；參照《中國藥典》2005年版“麝香”項(xiàng)下的含量測定方法［2］及有關(guān)文獻(xiàn)［3］，制定了制劑中麝香酮的氣相色譜分析法。方法簡便、準(zhǔn)確，分離度、穩(wěn)定性、重現(xiàn)性等均能滿足要求，可用于加味西黃軟膠囊的質(zhì)量評價。

1 儀器與試藥

SHIMADZU 10A高效液相色譜儀（日本島津）；SEDEX 75蒸發(fā)光散射檢測器；HW色譜工作站2.02版（南京千譜軟件公司研制）；Agilent 6890氣相色譜儀（美國安捷倫科技有限公司）；Sartorius CP225D型分析天平（十萬分之一）；AB204-N型分析天平（萬分之一）；超聲儀（功率250W，40KHz，上海船舶電子研究所）；膽酸對照品（中國藥品生物制品檢定所，批號：100078-200414）；麝香酮對照品（中國藥品生物制品檢定所，批號：110707-200107）；正十八烷（色譜純，美國Sigma公司）；甲醇（色譜純，美國TEDIA）；水為重蒸餾水；其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 膽酸的含量測定

2.1.1 色譜條件 色譜柱：Kromasil C18（5 μm，4.6 mm ×250 mm）；流動相：甲醇－0.1%冰醋酸（73∶27）；柱溫：30℃；流速：1.0 mL/min；ELSD檢測器參數(shù)：蒸發(fā)溫度：40℃，載氣（N2）壓力：200 kPa。

2.1.2 對照品溶液的制備 精密稱取膽酸對照品適量，加甲醇稀釋成每1 mL含膽酸50 μg的溶液。

2.1.3 供試品溶液的制備 取本品內(nèi)容物約0.8 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50 mL，密塞，稱定重量，超聲處理 30 min，放冷，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液即得。

2.1.4 空白試驗(yàn) 按加味西黃軟膠囊處方比例及制備方法，自制缺牛黃的陰性樣品，按2.3項(xiàng)下方法制備陰性樣品溶液。按上述色譜條件，吸取對照品溶液、供試品溶液和陰性樣品溶液各10 μL，分別注入液相色譜儀，測定。結(jié)果陰性無干擾，見圖1～3。

圖1 膽酸對照品HPLC色譜圖

圖2 膽酸供試品溶液HPLC色譜圖

圖3 牛黃陰性溶液HPLC色譜圖

2.1.5 線性關(guān)系 按對照品溶液制備方法，精密配制濃度為0.090 4 mg/mL的對照品溶液，精密吸取上述對照品溶液 0.5、1、2、3、5、10 mL，分別置 10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，各精密吸取10 μL進(jìn)樣，按上述色譜條件測定。以進(jìn)樣量的對數(shù)值（X：log M）為橫坐標(biāo)，峰面積的對數(shù)值（Y：log A）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，測定結(jié)果表明，膽酸在進(jìn)樣量45.2 ng～904 ng范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，回歸方程為：Y=1.121 3 X+2.418 7，r=0.999 9。

2.1.6 精密度試驗(yàn) 精密吸取對照品溶液15 μL，重復(fù)進(jìn)樣6次，測定峰面積。結(jié)果求得峰面積平均值為392 099；相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為0.67%。

2.1.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 將供試品溶液室溫下放置0、2、4、6、8、12、24 h，精密吸取 10 μL 進(jìn)樣，測定其峰面積，求得峰面積平均值為 525 327；RSD為1.25%（n=7），表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.8 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批號的樣品5份，照供試品溶液制備方法制備，精密吸取10 μL進(jìn)樣，測定，計(jì)算含量，結(jié)果平均含量為2.40 mg/g；RSD為1.49% 。結(jié)果表明本法的重復(fù)性良好。

2.1.9 回收率試驗(yàn) 精密稱取已知含量的樣品0.4 g，精密加入膽酸對照品，按供試品溶液的制備方法制備，并依法測定，計(jì)算，其平均回收率為99.06%，RSD=1.56% 。結(jié)果見表1。

表1 膽酸回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.1.10 樣品的測定 按擬定的含量測定方法，測定3批樣品中膽酸的含量，結(jié)果見表2。

表2 3批樣品膽酸測定結(jié)果

2.2 麝香酮的含量測定

2.2.1 氣相色譜（GC）條件 色譜柱：DB-1毛細(xì)管（30 m×0.32 mm ×0.25 μm）；FID檢測器；載氣：N2，1 mL/min；H2，40 mL/min；空氣：400 mL/min；進(jìn)樣口溫度：260℃，檢測器溫度：300℃，柱溫：為程序升溫，起始120℃，保持1 min，以 4℃/min升溫至160℃，保持15 min，再以10℃/min升溫至250℃，保持5 min。進(jìn)樣量：1 μL，分流進(jìn)樣，分流比：20∶1。

2.2.2 內(nèi)標(biāo)溶液、對照溶液的制備

近年來隨著素質(zhì)教育的推進(jìn)，雖然越來越多的準(zhǔn)大一新生在高考填報(bào)志愿時，通過網(wǎng)絡(luò)及相關(guān)的指導(dǎo)機(jī)構(gòu)，了解了專業(yè)培養(yǎng)目標(biāo)、專業(yè)所學(xué)課程、專業(yè)內(nèi)包含的相關(guān)職業(yè)，大致選擇了與自己興趣能力相匹配的專業(yè)，但是在踏入大學(xué)之門后，面對大學(xué)里各種各樣的社團(tuán)、學(xué)生組織，豐富多彩的學(xué)生活動，特別是自由自主的大學(xué)氛圍，學(xué)習(xí)上沒有人督促和監(jiān)督，突然不知道如何在學(xué)校里舉辦的各種活動和繁重的課業(yè)負(fù)擔(dān)之間找到平衡，整天忙碌卻不知忙碌的是什么，沒有一個明確的方向和目標(biāo)。

2.2.2.1 內(nèi)標(biāo)溶液的制備 稱取正十八烷適量，加乙醚制成每1 mL含0.1 mg的溶液。

2.2.2.2 對照品溶液制備 稱取麝香酮對照品適量，加乙醚制成每1 mL含1.0 mg的溶液。

2.2.2.3 校正因子測定 精密吸取對照品溶液2 mL，置10 mL量瓶中，加內(nèi)標(biāo)溶液稀釋至刻度，搖勻，吸取1 μL注入氣相色譜儀，連續(xù)進(jìn)樣3次，計(jì)算平均校正因子f=0.861 7。

2.2.3 供試品溶液制備方法 取本品內(nèi)容物0.8 g，精密稱定，置大試管中，精確加入內(nèi)標(biāo)溶液5 mL，密塞，超聲處理10 min，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.4 專屬性試驗(yàn) 配制缺麝香的陰性樣品，按供試品溶液制備方法配制陰性樣品溶液，吸取對照品溶液、供試品溶液、陰性樣品溶液各1 μL，注入氣相色譜儀中測定。結(jié)果表明：陰性樣品無干擾（見圖4～6）。

圖4 麝香酮對照品溶液GC色譜圖

圖6 麝香陰性溶液GC色譜圖

2.2.5 線性范圍 精確吸取對照品溶液0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL，分別置10 mL 量瓶，各精確加入5.0 mL內(nèi)標(biāo)溶液，用乙醚稀釋至刻度，搖勻，分別吸取1 μL注入氣相色譜儀，進(jìn)行測定。以對照品與內(nèi)標(biāo)峰面積的比值（Y：AR/AS）對對照品濃度（X：CR）進(jìn)行線性回歸，得回歸方程為：Y=4.390 X －0.016 1，r=0.999 9。表明麝香酮進(jìn)樣量在0.05～0.5 mg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.2.6 儀器精密度試驗(yàn) 精密吸取同一樣品溶液1 μL，按色譜條件連續(xù)重復(fù)進(jìn)樣 6次，計(jì)算麝香酮與內(nèi)標(biāo)物峰面積的比值，平均比值為1.055 5，RSD為0.98%。表明該儀器的精密度良好。

2.2.7 供試品溶液穩(wěn)定性考察 將西黃軟膠囊供試樣品溶液室溫保存，在 0、2、4、6、8、10 h 時進(jìn)樣，計(jì)算麝香酮與內(nèi)標(biāo)物峰面積的比值，平均比值為1.089 4，RSD為1.22%。結(jié)果表明：樣品溶液在10 h內(nèi)保持穩(wěn)定。

2.2.8 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批樣品6份，按含量測定方法操作，計(jì)算，平均含量為0.634 mg/g。結(jié)果表明方法重復(fù)性良好，RSD為1.65%。

2.2.9 回收率試驗(yàn) 精密稱取6份已知含量的西黃軟膠囊0.4 g，置大試管中，各精密加入麝香酮對照品溶液（0.252 mg/mL）1 mL，精確加入內(nèi)標(biāo)溶液5 mL，密塞，超聲處理10 min，過濾，取續(xù)濾液，即得測定用樣品溶液；按正文樣品含量測定方法進(jìn)行測定，計(jì)算準(zhǔn)確度，見表3。結(jié)果表明：本方法的準(zhǔn)確度較好，平均回收率為99.40%，RSD為0.95%。

表3 麝香酮回收率試驗(yàn)結(jié)果

表4 3批樣品麝香酮測定結(jié)果

3 討論

3.1 供試品溶液制備方法的選擇 本試驗(yàn)曾比較《中國藥典》（2005年版）牛黃膽酸和麝香的含量測定項(xiàng)下供試品的制備方法，結(jié)果表明本法操作簡便，主峰分離度高，膽酸和麝香酮含量基本提取完全。

3.2 膽酸流動相的選擇 由于膽酸在pH 4～6時，游離膽酸以離子型和非離子型2種形式存在，因此在流動相的選擇時發(fā)現(xiàn)，流動相pH對膽酸的色譜行為影響很大，只有采用酸性洗脫劑，較好的抑制膽酸電離，樣品才能得到較好的分離，且呈現(xiàn)1個對稱的色譜峰。同時由于樣品中成分的復(fù)雜，酸性洗脫劑沖柱的時間須適當(dāng)延長。

3.3 內(nèi)標(biāo)法計(jì)算麝香酮的含量 麝香酮的氣相色譜法采用手動進(jìn)樣，由于留針時間和室溫等對進(jìn)樣量的影響，使進(jìn)樣量不易精確控制，故采用內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行計(jì)算。

3.4 小結(jié) 本試驗(yàn)建立的膽酸的高效液相色譜法和麝香酮的氣相色譜法具有操作簡便，分析條件易于精確控制，重現(xiàn)性好和精密度高等優(yōu)點(diǎn)，為加味西黃軟膠囊的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立提供了科學(xué)依據(jù)。

［1］李曉蒙，劉惠瓊，程力惠.HPLC-ELSD測定清開靈顆粒中膽酸和豬去氧膽酸的含量［J］.中成藥，2007，29（4）：623-625.

［2］馬玲云，鄭笑為，馬雙成.HPLC-ELSD測定消痔靈片中膽酸的含量［J］.藥物分析雜志，2006，26（2）：250-252.

［3］袁紅宇，歐 寧，郭立瑋.HPLC-ELSD測定超細(xì)珠黃凝膠中膽酸的含量［J］.現(xiàn)代中藥研究與實(shí)踐，2005，19（6）：41-43.

［4］中國藥典［S］.一部.2005：48.

［5］李玲玲.大圣寶丹中麝香酮的氣相色譜法分析［J］.中成藥，2003，25（9）：768-769.

［6］張翠英，李振國，馬曉峰，等.毛細(xì)管色譜柱測定消癌膠囊中麝香酮和冰片的含量［J］.中國藥師，2007，10（11）：1101-1104.

Determination of cholic acid and muscone in Jawei Xihuang Soft Capsule

JIN Fen1， XIONG Fu-liang2， XIONG Deng-ke3， XIONG Li3， XIANG Yang3

（1.Hubei College of Traditional Chinese Medicine，Wuhan 430061，China；2.College of Chemical Engineering，Wuhan University of Technology，Wuhan 430070，China；3.Hubei Engineering Technology Centre of Modernization of TCM，Wuhan 430052，China）

Jawei Xihuang Soft Capsule；cholic acid；muscone；determination

AIM：To develop a method for determining cholic acid by HPLC-ELSD and GC was applied to determing muscone；in Jawei Xihuang Soft Capsule（Calculus Bovis，Moschus，Venenum Bufonis，Olibanum，Myrrha）.METHODS：A C18column（Kromasil C18，5 μm，4.6 mm × 250 mm）was used as stationary phase，the mobile phase was methanol－0.01%glacial acetic acid（73∶27）at a flow rate of 1.0 mL/min.The parameters of ELSD were set as follows：evaporation temperature was 40℃，carrier gas（N2）pressure was 200 kPa.The GC system consisted of DB-1 capillary column（30 m × 0.32 mm × 0.25 μm）and FID as the detector.The programmed temperature-GC and internal standard method were employed to determine the content of muscone.RESULTS：The linear ranges of cholic acid and muscone were in the range of 45.2 ng－904 ng and 0.05 mg/mL—0.5 mg/mL respectively.The average recoveries were 99.06%and 99.40%with RSD of 1.56%and 0.95%re-spectively.CONCLUSION：The method is convenient and accurate，and it can be used for the quality evaluation of Jawei Xihuang Soft Capsule.

R927.2

A

1001-1528（2010）03-0429-04

2009-02-18

金 芬（1982－），女，在讀碩士，研究方向：中藥新制劑、新劑型。Tel：15872376886

*通訊作者：熊富良，男，教授。Tel：（027）87850820 E-mail：fuliang_xiong@holley.cn