正交實(shí)驗(yàn)聯(lián)用星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法優(yōu)化紫草素脂質(zhì)體處方

邢建國(guó)，王新春，張永軍，袁勇，蒲宇紅

(1.新疆維吾爾自治區(qū)藥物研究所，新疆烏魯木齊830004;2.新疆石河子大學(xué)一附院，新疆石河子832008;3.新疆石河子大學(xué)藥學(xué)院，新疆石河子832008)

新疆軟紫草為紫草科多年生草本植物，具有多種生物學(xué)作用［1-2］。紫草素為紫草中脂溶性很強(qiáng)的萘醌類色素，具有逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞多藥耐藥［3］和廣泛的抗腫瘤作用［4］，但紫草素水溶性差的性質(zhì)影響了其在醫(yī)藥領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用。脂質(zhì)體作為難溶于水的藥物輸送載體具有許多優(yōu)越性，其所具有的生物膜特性可將難溶藥物包埋于脂質(zhì)體雙分子層所形成疏水腔內(nèi)，使得藥物粒子溶解度增大，促進(jìn)被包裹的難吸收性的藥物在腸道的傳遞，提高其生物利用度。

在脂質(zhì)體處方優(yōu)化中，常需考察多個(gè)因素的多個(gè)水平，因此，尋找一種實(shí)驗(yàn)次數(shù)少、而實(shí)驗(yàn)結(jié)果接近全面實(shí)驗(yàn)優(yōu)化出的結(jié)果的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方法是每位研究者十分關(guān)心的問(wèn)題。正交設(shè)計(jì)［5］、均勻設(shè)計(jì)［6］和星點(diǎn)設(shè)計(jì)－效應(yīng)面優(yōu)化法［7］是常采用的試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法。其中正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)安排的實(shí)驗(yàn)具有均衡搭配的特點(diǎn)，但其所建立的指標(biāo)和因素之間關(guān)系的數(shù)學(xué)模型是一種線性模型，因此模型的精度不夠、預(yù)測(cè)性較差。星點(diǎn)設(shè)計(jì)－效應(yīng)面優(yōu)化法是一種多元非線性擬合的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方法，所建立的非線性數(shù)學(xué)模型精度高、預(yù)測(cè)性較好。但若需考察的因素較多時(shí)，則存在實(shí)驗(yàn)次數(shù)偏高的不足，如五因素則需52次試驗(yàn)。因此，基于正交設(shè)計(jì)和均勻設(shè)計(jì)聯(lián)用的研究［8］結(jié)合正交設(shè)計(jì)與星點(diǎn)設(shè)計(jì)兩種設(shè)計(jì)方法的各自特點(diǎn)，在進(jìn)行紫草素脂質(zhì)體處方優(yōu)化過(guò)程中，首先采用正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)試驗(yàn)次數(shù)較少的特點(diǎn)，進(jìn)行多因素的初步篩選，再將所確定的主要影響因素采用預(yù)測(cè)精度較高的星點(diǎn)設(shè)計(jì)非線性數(shù)學(xué)模型進(jìn)行優(yōu)化，旨在達(dá)到利用較少的試驗(yàn)次數(shù)得到具有較高預(yù)測(cè)精度的數(shù)學(xué)模型的研究目的，進(jìn)而保證紫草素脂質(zhì)體的處方優(yōu)化的準(zhǔn)確性。

1 藥物、試劑和儀器

紫草素(青島市海大化工有限公司);大豆磷脂(上海太偉藥業(yè)有限公司，批號(hào)070614，含量90%);膽固醇(上海生物化學(xué)試劑公司，批號(hào)051023);乙醇、曲拉通等試劑為分析純。

SPD-10ATVP液相色譜儀(日本島津);85-2A數(shù)顯式磁力加熱攪拌器(江蘇省金壇市榮華實(shí)驗(yàn)儀器廠);電子分析天平(德國(guó)賽多利斯Sartorius);BP211D臺(tái)式離心機(jī)TGL-16G(上海安亭科學(xué)儀器廠);KQ-250B型超聲清洗器(昆山市超聲儀器有限公司);90plus激光粒度分析儀(美國(guó)Brookhaven);SAS統(tǒng)計(jì)軟件(Release 8.20，SAS Institute Inc.);Origin6.0繪圖軟件(Microcal Software Inc.)。

2 方法與結(jié)果

2.1 紫草素脂質(zhì)體的制備［8］

結(jié)合實(shí)驗(yàn)室條件及預(yù)試驗(yàn)研究結(jié)果，采用乙醇注入法制備紫草素脂質(zhì)體。分別取處方量的大豆磷脂、膽固醇、紫草素于棕色瓶中，精密稱定。加入適量無(wú)水乙醇，超聲使完全溶解。在600 r/min機(jī)械攪拌條件下，將所得的乙醇混合物溶液注入到含甘露醇的水性溶液中，室溫?cái)嚢? min，得到脂質(zhì)體膠體分散液。

2.2 載藥量和包封率的測(cè)定

紫草素脂質(zhì)體中紫草素的含量用高效液相色譜法測(cè)定。色譜柱:AgilentXDB C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動(dòng)相:甲醇-0.025 mol/L磷酸(78∶22);柱溫:25℃;流速:1.0 mL/min;測(cè)定波長(zhǎng):516 nm，進(jìn)樣量20 μL。載藥脂質(zhì)體和游離藥物采反相透析法分離。含藥脂質(zhì)體0.5%曲拉通乙醇溶液超聲10 min進(jìn)行消解。高效液相色譜法檢測(cè)，每批樣品測(cè)定3次計(jì)算藥物包封率和載藥量。

2.3 納米粒粒徑及分布的測(cè)定方法［9］

待測(cè)樣品的平均粒徑及粒度分布用90plus激光粒度分析儀測(cè)定。

2.4 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

按L8(27)安排實(shí)驗(yàn)，依據(jù)文獻(xiàn)及預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果初步考察藥物與脂質(zhì)比(X1)、大豆磷脂濃度(X2)、有機(jī)相和水相體積比(X3)、大豆磷脂與膽固醇比(X4)、甘露醇濃度(X5)5種影響因素，以包封率(EE%)、載藥量(DL%)及歸一化值為指標(biāo)，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行直觀分析及方差分析，確定主要影響因素。因素-水平表見表1。

表1 L8(27)正交實(shí)驗(yàn)因素-水平表

依據(jù)正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)篩選結(jié)果，按三因素五水平星點(diǎn)設(shè)計(jì)安排實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步考察影響處方配比的主要因素X1、X3及X4對(duì)包封率、載藥量及歸一化值(OD)三個(gè)評(píng)價(jià)指標(biāo)的影響，依據(jù)三次多項(xiàng)式非線性回歸方程及效應(yīng)面法確定紫草素脂質(zhì)體處方的最佳配比。因素-水平表，見表2。

表2 星點(diǎn)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平表

2.5 數(shù)據(jù)處理與結(jié)果分析

2.5.1 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果處理

采用正交設(shè)計(jì)助手v3.1軟件，綜合考慮各因素對(duì)包封率、載藥量及歸一值的影響，確定主要影響因素為大豆磷脂濃度、藥脂比和有機(jī)相-水相體積比。次要因素進(jìn)一步確定為甘露醇濃度2%、大豆磷脂與膽固醇比4∶1。試驗(yàn)結(jié)果見表3。

表3 正交試驗(yàn)結(jié)果

2.5.2星點(diǎn)設(shè)計(jì)模型擬合

用SAS8.0統(tǒng)計(jì)軟件，以各評(píng)價(jià)指標(biāo)(因變量)分別對(duì)各因素(自變量)選擇3種數(shù)學(xué)模型進(jìn)行曲線擬合。模型如下:

多元線性方程:D=b0+b1x1+b2x2+b3x3

二次多項(xiàng)式:D=b0+b1x1+b2x2+b3x3+b4x1x2+b5x1x3+b6+b7x2x3+b8+b9

三次多項(xiàng)式:

D=b0+b1x1+b2x2+b3x3+b4x1x2+b5x1x3+b6+b7x2x3+b8x22+b9x23+b10+b11x1+b133+b14x2

三個(gè)指標(biāo)的多元線性回歸方程結(jié)果顯示，盡管模型可以通過(guò)檢驗(yàn)，但模型擬合的相關(guān)度不佳，因此應(yīng)采用多元高次的數(shù)學(xué)模型。三個(gè)指標(biāo)二次多項(xiàng)式回歸方程的擬合結(jié)果是，各項(xiàng)系數(shù)的估計(jì)值多數(shù)不能通過(guò)P<0.2的檢驗(yàn)，一定程度的簡(jiǎn)化后仍不能通過(guò)P<0.1的檢驗(yàn);三次多項(xiàng)式方程的擬合結(jié)果則各項(xiàng)系數(shù)在刪除P>0.2的項(xiàng)后，進(jìn)行t檢驗(yàn)，三個(gè)指標(biāo)的方程均通過(guò)P<0.005的檢驗(yàn)，模型擬合優(yōu)度好。

三個(gè)指標(biāo)的三次多項(xiàng)式方程如下:

y1=172.193+25.881X1－533.374X2－25.586X3－196.211X1X2－0.254X1X3+139.156X2X3+0.489X3X3+367.979X1X2X2－135.832X2X2X3－1.585X2X3X3R=0.991 0

y2=－1.643+3.247X1－0.792X3－17.069X1X2－0.107X1X1+6.087X2X3+0.285X1X1X2+25.296X1X2X2－9.875X2X2X3R=0.974 5

y3=－0.163+0.767X1－0.216X3－3.965X1X2－0.035 0X1X1+1.274X2X3+0.001 54X3X3+0.100X1X1X2+5.447X1X2X2－2.010X2X2X3R=0.987 6

上述結(jié)果顯示，包封率、載藥量和歸一化值三指標(biāo)的三項(xiàng)式擬合均比線性模型相關(guān)系數(shù)高。

2.6 優(yōu)化工藝

固定3個(gè)自變量中影響較弱者，設(shè)為中值，代入原方程，應(yīng)用Origin6.0軟件分別繪制各指標(biāo)與影響較顯著的2個(gè)自變量的三維效應(yīng)面和二維等高圖。從三維效應(yīng)面圖和等高圖中，選取包封率和載藥量較高及綜合指標(biāo)較理想的區(qū)域，求其相應(yīng)的自變量范圍，得較優(yōu)處方為X1=8%，X2=0.45%，X3=20。根據(jù)優(yōu)化處方平行制備3份樣品，所得脂質(zhì)體的包封率、載藥量分別為85.4%，載藥量為5.16%，偏差的絕對(duì)值均小于5%，平均粒徑為98.1 nm、多分散指數(shù)為0 203，說(shuō)明模型預(yù)測(cè)性好。

3 討論

3.1 用線性數(shù)學(xué)模型進(jìn)行擬合的正交實(shí)驗(yàn)方法是一種實(shí)驗(yàn)次數(shù)少、預(yù)測(cè)性精度不高的方法;星點(diǎn)設(shè)計(jì)是一種非線性數(shù)學(xué)模型擬合的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方法，是根據(jù)模型所建立的效應(yīng)面的區(qū)域進(jìn)行篩選，具有預(yù)測(cè)精度高的特點(diǎn)，但考察因素多時(shí)，實(shí)驗(yàn)次數(shù)也較多。本實(shí)驗(yàn)將兩者有機(jī)地結(jié)合，采用正交實(shí)驗(yàn)，通過(guò)較少的實(shí)驗(yàn)次數(shù)確定主要影響因素，在此基礎(chǔ)上采用星點(diǎn)設(shè)計(jì)進(jìn)一步優(yōu)化，對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行模型預(yù)測(cè)。驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，兩個(gè)方法的聯(lián)用不僅提高了實(shí)驗(yàn)效率，而且使預(yù)測(cè)結(jié)果具有較高的準(zhǔn)確性。因此，是一種簡(jiǎn)便、可行及可靠的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方法，尤其更適用于影響因素較多的實(shí)驗(yàn)。

3.2 目前微粒給藥系統(tǒng)中用于藥物包封率測(cè)定的方法有超速離心法、離心超濾法、柱分離法等。本實(shí)驗(yàn)依據(jù)文獻(xiàn)［10］建立了反相透析法測(cè)定藥物包封率的方法，同時(shí)對(duì)各方法進(jìn)行比較研究，結(jié)果表明，該方法與上述方法相比，具有經(jīng)濟(jì)、簡(jiǎn)便和準(zhǔn)確的特點(diǎn)，是一種用于處方和工藝篩較為理想、可靠的方法。

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