血管緊張素Ⅱ受體抑制劑對(duì)雌激素誘導(dǎo)的Ishikawa細(xì)胞的增殖及凋亡的影響

蘇卿，楊清

（中國醫(yī)科大學(xué) 附屬盛京醫(yī)院第一微創(chuàng)婦科，沈陽 110004）

肥胖、高血壓、糖尿病是子宮內(nèi)膜癌的高危因素，被稱為“宮體癌綜合征”。而肥胖、高血壓和糖尿病患者體內(nèi)的血管緊張素Ⅱ水平及雌激素水平均較高，所以我們選擇saralasin（沙拉新，血管緊張素Ⅱ抑制劑）來阻斷，探討血管緊張素Ⅱ受體在子宮內(nèi)膜癌中的作用。本研究應(yīng)用四甲基亞唑藍(lán)（MTT）和流式細(xì)胞技術(shù)觀察saralasin對(duì)雌激素作用下的子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的增殖、凋亡和細(xì)胞周期的影響。

1 材料

1.1 細(xì)胞系

人子宮內(nèi)膜癌ishikawa細(xì)胞系來源日本大學(xué)婦產(chǎn)科實(shí)驗(yàn)室饋贈(zèng)，經(jīng)檢測雌激素受體和孕激素受體表達(dá)均陽性。

1.2 試劑

水溶性17β-雌激素、saralasin、四甲基亞唑藍(lán)（MTT）和碘化丙啶（PI）購自美國sigma公司，兔抗人AT1-R購于博奧森生物公司，AT1-R山羊抗兔TITC標(biāo)記熒光抗體購于北京中杉生物公司，AnnexinⅤ-TITC試劑盒購于晶美生物公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)：ishikawa細(xì)胞培養(yǎng)于含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)液中，于37℃、體積分?jǐn)?shù)5%ml/L的CO2孵育箱中培養(yǎng)貼壁生長，取對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 免疫熒光技術(shù)：檢測AT1-R在ishikawa細(xì)胞的表達(dá)，以PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。

1.2.3 細(xì)胞增殖率的測定：應(yīng)用MTT的方法，設(shè)立調(diào)零孔及等量含有相同濃度的DMSO的DMEM培養(yǎng)液作為陰性對(duì)照，試驗(yàn)孔中加入雌激素濃度分別為 10-6、10-8、10-10、10-12mol/l，每列設(shè) 5 復(fù)孔。于加藥后30 min后終止反應(yīng)，測吸光度（A）值。同理，確定雌激素濃度后我選擇 5、10、15、30、60 和 120 min 測其作用時(shí)間；測saralasin的作用濃度和各實(shí)驗(yàn)組不同時(shí)間的增殖率，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，增殖率或抑制率=（實(shí)驗(yàn)組-對(duì)照組）/（對(duì)照組-空白組）。

1.2.4 細(xì)胞周期的測定：實(shí)驗(yàn)分分3組，第1瓶加入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液4ml。第2瓶加入雌激素濃度為10-8mol/l的DMEM培養(yǎng)液4 ml，第3瓶加入含雌激素濃度為10-8mol/l和saralasin濃度為10-6mol/l的DMEM培養(yǎng)液4 ml，分別于加藥后10 min終止反應(yīng)，取1×106個(gè)細(xì)胞打入預(yù)冷的5 ml 70%的乙醇中，封口膜封口，4℃固定過夜，加入RNase-A 3 ul至濃度為 50 ug/ml，37℃水浴消化 30 min，加PI76 ul至濃度約為100 ug/ml，在冰浴中避光染色30 min。流式細(xì)胞儀上計(jì)數(shù)細(xì)胞，采用細(xì)胞周期分析軟件處理。

1.2.5 細(xì)胞凋亡的檢測：采用AnnexinⅤ/PI雙染色法，各組加入處理因素，作用10 min后，按照試劑盒操作步驟收集細(xì)胞、處理樣本，立即上機(jī)檢測。

1.2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以x±s表示，分析采用方差分析，組間比較用LSD法，P<0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 免疫熒光結(jié)果

用AT1-R抗體做免疫熒光實(shí)驗(yàn)在熒光顯微鏡下觀察，結(jié)果如下可見實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)染成綠色，呈陽性表達(dá)，核染成藍(lán)色。陰性對(duì)照組細(xì)胞不著色。（圖1）

2.2 MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 雌激素對(duì)ishikawa細(xì)胞增殖影響：各種濃度的雌激素 （10-12mol/L，10-10mol/L，10-8mol/L，10-6mol/L，10-4mol/L）促增殖作用比較，以10-8mol/L作用最強(qiáng)，所以以后試驗(yàn)組以雌激素濃度為10-8mol/L作為誘導(dǎo)濃度；測 5 min、10 min、15 min、30 min、60 min和120 min雌激素對(duì)ishikawa細(xì)胞的促增殖作用，以30 min作用最強(qiáng)。雌激素對(duì)ishikawa細(xì)胞具有促進(jìn)細(xì)胞增殖的作用，具有劑量依賴性和時(shí)間依賴性。

2.2.2 saralasin對(duì)ishikawa細(xì)胞增殖的影響：saralasin對(duì)ishikawa細(xì)胞的抑制作用具有濃度依賴性。隨著 saralasin 濃度 10-5mol/L、10-6mol/L、10-7mol/L的增加其對(duì)ishikawa細(xì)胞的抑制率36.30%、25.34%、19.29%也增加。

2.2.3 saralasin對(duì)不同時(shí)間雌激素誘導(dǎo)的ishikawa細(xì)胞增殖的影響（表1）：以上數(shù)據(jù)中根據(jù)先期試驗(yàn)先確定了雌激素的誘導(dǎo)濃度10-8mol/L和saralasin的濃度10-6mol/L，然后發(fā)現(xiàn)saralasin在5 min時(shí)已經(jīng)開始起抑制作用，在雌激素誘導(dǎo)下，不同時(shí)間各組間只有10min組與對(duì)照組比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。因此我們后續(xù)實(shí)驗(yàn)采用10 min，來研究細(xì)胞周期和凋亡。

表1 saralasin對(duì)雌激素誘導(dǎo)不同時(shí)間下ishikawa細(xì)胞增殖的作用Tab.1 The effect of saralsin on the proliferation of ishikawa induced by estrogen

2.3 細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn)結(jié)果

流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期結(jié)果見圖2：雌激素組G0/G1期減少，S期增多；saralasin組G0/G1期增多，S期減少，這提示saralasin使雌激素誘導(dǎo)10 min的ishikawa細(xì)胞發(fā)生了G0/G1阻滯，抑制了細(xì)胞生長。各組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

2.4 細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)結(jié)果

各組細(xì)胞經(jīng)AnnexinⅤ/PI染色，流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果如圖3所示，saralasin能在10 min使雌激素誘導(dǎo)的ishikawa細(xì)胞發(fā)生凋亡，正常對(duì)照組細(xì)胞早期凋亡率為9.54%，雌激素組細(xì)胞早期凋亡率6.87%，saralasin組細(xì)胞早期凋亡率為13.19%，各組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；晚期凋亡率和壞死率正常對(duì)照組為4.13%，雌激素組為4.79%，saralasin組為8.54%，各組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

3 討論

3.1 雌激素對(duì)子宮內(nèi)膜癌ishikawa細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡的作用

目前研究認(rèn)為雌激素有轉(zhuǎn)錄和非轉(zhuǎn)錄兩種效應(yīng)，都是通過與其受體結(jié)合實(shí)現(xiàn)的，也有學(xué)者［1］認(rèn)為雌激素與其受體結(jié)合后上述兩種效應(yīng)協(xié)同發(fā)揮作用，促進(jìn)細(xì)胞增殖。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示，雌激素能夠促進(jìn)ishikawa細(xì)胞增殖，且具有時(shí)間和濃度依賴性，在2 h內(nèi)其刺激增殖作用以30min最強(qiáng)；使ishikawa細(xì)胞G1期下降，S期升高。雌激素能使子宮內(nèi)膜癌ishikawa細(xì)胞周期中G1期比例下降，S期比例增高，可見雌激素能誘導(dǎo)細(xì)胞的DNA合成增多，加快細(xì)胞G1期到S期的過渡，導(dǎo)致細(xì)胞的過度增殖。在30 min促進(jìn)增殖作用最強(qiáng)，說明其刺激增殖作用主要是通過非轉(zhuǎn)錄效應(yīng)實(shí)現(xiàn)的。在雌激素作用10 min后凋亡結(jié)果顯示，雌激素能使細(xì)胞的凋亡受到抑制，說明可能存在快速抑制凋亡的途徑。

3.2 Saralasin對(duì)子宮內(nèi)膜癌ishikawa細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡的作用

Saralasin是競爭性肽類AngⅡ受體抑制劑，具有在各種組織中與AngⅡ結(jié)合部位的高親和性，不影響AngⅠ向AngⅡ轉(zhuǎn)化，與其他激素受體無親和力，可以用saralasin阻滯，說明與AngⅡ受體在細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡中的作用。

研究表明有些腫瘤攜帶AT1-R，且AngⅡ及AT1-R可促進(jìn)血管生成和癌細(xì)胞生長［2，3］。另外，大多數(shù)實(shí)體瘤患者，當(dāng)被診斷為腫瘤時(shí)，其體內(nèi)的基因已有多種改變，足以對(duì)抗單一的分子靶向治療。蛋白激酶C可以作為第二信使，可激活MAPK或PI3K/AKt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用，因此我們選擇性的減少蛋白激酶C的產(chǎn)生，對(duì)預(yù)防腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及改善甚至其轉(zhuǎn)歸都可能有重要作用。AngⅡ可以作用于AT1受體激活蛋白激酶C，因此試用saralasin阻斷其作用途徑，來探討其抑制MAPK或PI3K/Akt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，進(jìn)而抑制腫瘤細(xì)胞增殖的作用機(jī)制。本實(shí)驗(yàn)MTT結(jié)果顯示，saralasin對(duì)細(xì)胞增殖有比較明顯的抑制作用，且具有濃度-時(shí)間依賴性；從相對(duì)抑制率看，在10 min時(shí)有相對(duì)明顯的抑制作用，說明saralasin起作用早，可能存在與雌激素類似的快速的非轉(zhuǎn)錄作用抑制途徑，15 min作用減弱，30 min后抑制作用逐漸增強(qiáng)，這可能是隨著雌激素的刺激增殖能力增強(qiáng)，saralasin的作用相對(duì)減弱，在30 min后，雌激素的作用減弱，saralasin的作用更加明顯，說明此藥可能在短時(shí)間內(nèi)一直存在著對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制作用。

流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期發(fā)現(xiàn)，saralasin阻滯ishikawa細(xì)胞于G0/G1期，細(xì)胞凋亡增加，可能通過AT1-R干擾多種細(xì)胞蛋白的功能；因此我們下一步將用siRNA方法沉默AT1-R檢測周期和凋亡情況及相關(guān)蛋白的變化。

3.3 saralasin的應(yīng)用前景

本研究結(jié)果顯示，AT1受體競爭性抑制劑saralasin對(duì)人子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞系ishikawa的增殖有明顯的抑制作用，可使細(xì)胞周期停滯G1期，并可誘導(dǎo)ishikawa 細(xì)胞凋亡。這與 Arrieta［4］、Yamagishi［5］等首次用AT1-R拮抗劑坎地沙坦（candesartan），4 mg/d治療激素抵抗的前列腺癌患者，取得較好的療效的結(jié)果比較接近。AT1受體抑制劑對(duì)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞有抑制增殖、誘導(dǎo)凋亡的作用。這可能為研究子宮內(nèi)膜的發(fā)病機(jī)制提供新線索，同時(shí)為子宮內(nèi)膜癌的化療提供新方向，減少化療反應(yīng)。

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［3］吳若飛，劉景晶.血管緊張素Ⅱ受體與腫瘤關(guān)系的研究進(jìn)展［J］.現(xiàn)代醫(yī)學(xué)，2005，33（6）：414-416.

［4］Arreta O，Guevara P，Escobar E，et al.Blockageof angiotensin IItype Ireceptor decreasesthesynthesisof growth factorsand inducesapoptosisin C6 cultured cellsand C6 rat glioma［J］.Br JCancer，2005，92（7）：1247-1252.

［5］Yamagishit，Uemura H，Nakaigawa N，et al．Angiotensin Ⅱ blocker de-creases serum prostate specific antigen in hormone refractory prostatecancer［J］.JUrol，2005，173（2）：441-441.