豚鼠心室肌細胞的分離及其基本電生理特性的觀察

趙美瞇，趙金生，高青華，何桂林，郝麗英

（中國醫(yī)科大學 藥學院藥物毒理學教研室，沈陽 110001）

心肌電生理學是心臟電學的重要組成部分，開創(chuàng)于20世紀的40~50年代［1］，隨著膜片鉗制技術的發(fā)展及其在心肌細胞上的應用，特別是以鈣離子內流為主的慢內向電流的發(fā)現(xiàn)，帶動了心肌電生理學的進一步深入發(fā)展。心肌細胞動作電位的研究是心肌電生理學研究必要的第一步。1964年Trautwein第一次用雙電極電壓鉗制技術在犬的Purkinje纖維上記錄出了心肌細胞的離子流，Hamill等［2］改進了Neher和Sakmann的膜片鉗技術［3］，使其能夠適用于心肌細胞電流的記錄，20世紀80年代研究者發(fā)現(xiàn)并闡明了心肌細胞各種主要離子流的基本特性，特別是發(fā)現(xiàn)了神經纖維所不具有的慢內向鈣電流。

在心肌細胞標本方面，Kono等［4］建立了用膠原酶和胰蛋白酶分離大鼠心肌細胞的方法，取代了以往的機械分離方法。Yazawa等［5］采用膠原酶等也分離出了豚鼠的心室肌細胞。然而，如何獲得有效而穩(wěn)定的心肌細胞卻一直困擾著心肌電生理學研究者。本研究在以往方法的基礎上對豚鼠心室肌細胞分離方法進行了摸索及完善，并記錄觀察了所獲細胞的動作電位和代表性離子流鈣電流的基本特性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物：雌性豚鼠，體質量300~400 g，由中國醫(yī)科大學實驗動物中心提供。

1.1.2 試 劑 ：NaCl，KCl，MgCl2，CaCl2，NaOH，KOH，NaH2PO4，KH2PO4，Glucose 和 Taurine 均為國產市售分析純試劑，Glutamic acid和HEPES購自Amresco公司，K-Aspartate購自日本 TCI公司，K2ATP和Na2CrP購自Sigma公司，EGTA購自日本DOJINDO公司，Protease購自Sigma公司，Collagenase購自日本 Yakult公司（Lot No：208054）。

1.1.3 溶液配制：臺式液（Tyrodessolution，mmol/L）：NaCl 135，KCl 5.4，MgCl21.0，NaH2PO40.33，HEPES 10，Glucose 5.5，CaCl21.8，用氫氧化鈉調 pH 至 7.4。無鈣臺氏液（Ca2+-free tyrodessolution）：未加CaCl2的臺式液。電極內液（electrode internal solution，mmol/L）：K-Aspartate 110，KCl 30，MgCl21，K2ATP 5，Na2CrP 5，HEPES5，EGTA 10，CaCl21.43（pCa 8），用氫氧化鉀調pH至7.2。液接電位約為10 mV。KB液（Kraftbrühe-modified solution，mmol/L）：Glutamic acid 50，KCl 40，Taurine 20，KH2PO420，Glucose 10，HEPES10，EGTA 0.5，MgCl23，用 KOH 調 pH 至 7.4。

1.2 方法

1.2.1 豚鼠單個心室肌細胞的分離：豚鼠腹腔注射1%戊巴比妥鈉110 mg/kg麻醉后，仰臥位固定。行氣管插管，接上小動物呼吸機給予正壓人工呼吸（潮氣量4 ml，60次/min，呼氣∶吸氣為3∶1）。用止血鉗在2、3肋間隙與胸骨交界處打開胸腔，充分暴露心臟和升主動脈。進行原位主動脈插管，固定插管。游離心臟后置于Langendorff裝置進行主動脈逆行灌流。先用臺式液灌流約3 min，再用無鈣臺式液灌流約 6 min，然后用含膠原酶（濃度 0.06～0.08 mg/ml）的無鈣臺式液消化8～18 min，最后用KB液沖洗殘酶約5 min。整個灌流系統(tǒng)用恒溫水浴保持在37℃，所有液體均用純氧飽和。灌流完畢，取下心臟，放入室溫的KB液中剪碎心室肌，輕涮得到單個細胞懸液。經105μm的鋼絲膜濾過后，置于含蛋白酶（0.05 mg/ml）的KB液中37℃水浴均勻振蕩4 min。離心3次（800 r/min，3 min）去除殘留酶，最后置于 4℃的KB液中靜置1 h后進行實驗。

1.2.2 膜片鉗全細胞記錄：取細胞懸液加入倒置顯微鏡（日本Olympus公司）灌流浴槽中，待細胞沉底后用臺式液慢慢灌流復鈣10～20 min。待心室肌細胞貼壁呈靜息狀態(tài)，在臺式液灌流（0.5～2 ml/min）狀態(tài)下，開始膜片鉗全細胞記錄實驗。玻璃微電極（美國Fisher公司）由P-97（美國Sutter公司）分4步拉制而成。利用三維操縱器移動電極，最終輕輕貼在細胞表面。輕輕給予負壓形成高阻封接，繼續(xù)施加負壓吸破細胞膜，形成全細胞記錄模式。信號經Pt電極引導，由Axopatch 200B膜片鉗放大器（美國Axon公司）放大，通過Digidata 1440數(shù)模/模數(shù)轉換器（美國Axon公司），由計算機pClamp10軟件采集數(shù)據(jù)，并進行數(shù)據(jù)分析。實驗數(shù)據(jù)以x±s表示。

2 結果

2.1 分離細胞的形態(tài)學

用臺式液緩慢灌流復鈣后，存活的單個心室肌細胞達50%～70%；部分細胞鈣負載后自發(fā)性收縮，短時間內縮成團塊死亡（圖1A）。高倍鏡下可見，存活細胞形態(tài)良好，呈桿狀或柱狀，具有清晰的橫紋（圖1B）。本方法分離所得的心室肌細胞在KB液中保存10 h以上仍可存活，適用于膜片鉗實驗。

2.2 分離細胞的動作電位

形成全細胞記錄方式后，在電流鉗模式下，給予4 nA×3 ms電流刺激，誘發(fā)出心室肌細胞動作電位（圖2）。其靜息電位（-69.9±3.4）mV；幅度（158.0±4.6）mV；復極到50%時的動作電位時程（action potential durationat50%of repolarization，APD50）為（189.2±40.3）ms；復極到95%時的動作電位時程（action potential durationat95%ofrepolarization，APD95）為（313.1±38.9）ms（n ＝ 9）。

2.3 分離細胞的L型鈣通道電流

2.3.1 全細胞記錄L型鈣通道電流：形成全細胞記錄模式后，在電壓鉗狀態(tài)下，由-40 mV的保持電位去極化到0 mV，刺激電壓持續(xù)200 ms，此時記錄到一個緩慢失活的內向電流，即為L型鈣通道電流（圖3）。其電流峰值為（-466.3±35.0）pA（n=10）。

2.3.2 L型鈣通道電流的電流-電壓（I-V）曲線：在電壓鉗狀態(tài)下，以10 mV步階使心室肌細胞由-40 mV逐步去極化到+50 mV，刺激電壓持續(xù)300 ms，保持電位-40 mV，此時記錄到一系列的電流（圖4），作IV曲線（圖5）。結果顯示，當膜電位去極化至0～10 mV，鈣通道電流達峰值。其反轉電位值為（43.5±1.2）mV（n ＝8）。

3 討論

實驗結果表明，本方法獲得的心室肌細胞具有較好的耐鈣性，基本避免了心肌細胞在正常鈣濃度外液中因鈣反常［6～9］現(xiàn)象而導致細胞大量死亡的問題。從膜靜息電位和動作電位結果看，具有正常心室肌細胞的興奮性。豚鼠心室肌離子通道分布及動作電位形態(tài)與人相似，具有明顯的2相平臺期。它主要由緩慢內向電流鈣電流及外向電流延遲整流鉀電流共同形成［10］，而大鼠的心室肌細胞上因缺少外向電流延遲整流鉀電流，沒有明顯的平臺期［11］。鈣電流記錄結果顯示，所獲心室肌細胞具有典型的L型鈣離子通道功能，適用于膜片鉗電生理研究。關于全細胞鈣電流記錄，可通過在細胞外液中加入河豚毒素阻斷鈉通道，得到一個緩慢內向電流。而本實驗中選用正常臺式液作為細胞外液，保持電位在-40 mV，同樣也記錄到典型L型鈣通道電流，且更接近正常生理環(huán)境，保持心肌細胞正常形態(tài)，更有利于封接。

本實驗中我們總結影響分離所得細胞產量和質量的關鍵因素如下：（1）在體游離心臟，行主動脈逆行插管：與以往的直接開胸摘出心臟的方法相比較，配合人工呼吸的在體主動脈逆行插管，可避免手術中心肌細胞缺血缺氧［12］。操作難點是主動脈插管的深度把握，若插管過深通過主動脈瓣進入左心室，灌流液不能很好地流入冠狀動脈系統(tǒng)，直接進入心室造成內壓增高，使心內膜以至整個心臟都無法得到良好的灌注，導致細胞產量降低，且大多為死亡細胞。（2）注意膠原酶的消化時間：膠原酶消化之前，無鈣臺式液灌流約6 min。若灌流時間過短，脫鈣不完全，冠脈未處于完全舒張狀態(tài)，會影響膠原酶溶液灌流，從而影響心肌細胞消化；相反，若時間過長，長時間處于無鈣環(huán)境中又會引起“鈣反?！保?3］。本實驗采用單一膠原酶消化，易控制消化程度。根據(jù)豚鼠體重和灌流液流速適當延長或縮短消化時間，即可達到相同的消化效果。此外，應注意酶的生產廠家，生產批號不同，酶的活性也可能不同。若更換新酶或新批號，應注意根據(jù)酶活性大小適當調節(jié)酶的劑量。（3）微量蛋白酶處理細胞表面：在過濾后細胞懸液中加入微量蛋白酶，可減少細胞表面的糖被層，達到單細胞分散效果，更有利于膜片鉗實驗中電極與細胞膜之間形成高阻封接［14］。（4）KB液保存：細胞保存在高鉀的KB液中，可顯著延長細胞存活時間，研究表明保存其中的細胞具有正常電生理特性［15］。在本實驗中使用KB液保存的細胞在復鈣沖洗后其數(shù)量和電生理活性均可支持完成膜片鉗實驗，并在保存液中可存活達10 h。（5）水質等其他重要因素：實驗中所用灌流液均用Milli-Q水配制，其電阻值≥18 MΩ。膠原酶在適當溫度下才能發(fā)揮最大活性，因此需用循環(huán)恒溫水浴保證灌流溫度于37℃。整個灌流系統(tǒng)要排盡氣泡，避免空氣栓塞等導致冠脈局部不暢、周邊心肌細胞死亡。灌流液需通氧氣飽和，減輕灌流消化過程中引起的細胞缺氧甚至死亡。實驗中對上述各方面細節(jié)的嚴格控制是獲得穩(wěn)定及反應性良好細胞的關鍵。

總之，本方法分離所得豚鼠心室肌細胞具有正常的離子通道功能，適用于膜片鉗技術對心肌電生理特性的研究。本實驗操作易于掌握，是一種簡單有效的急性分離心室肌細胞的方法。

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