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    VEGF在小劑量超短波促進種植骨髓間充質(zhì)干細胞脫細胞支架修復大鼠坐骨神經(jīng)損傷中的表達

    2010-05-25 01:43:22龐超見佟曉杰劉貴波李奇賈樺王瑩高海
    中國醫(yī)科大學學報 2010年4期
    關鍵詞:施萬超短波支架

    龐超見,佟曉杰,劉貴波,李奇,賈樺,王瑩,高海

    (中國醫(yī)科大學 基礎醫(yī)學院解剖學教研室,沈陽 110001)

    血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)是一類多功能的生長因子,通過與特異性的受體結合可促進內(nèi)皮細胞增殖、誘導血管形成,對調(diào)節(jié)生理性與病理性血管生長起著重要的作用,因而被應用于缺血性血管疾病的治療。隨著組織工程學的不斷發(fā)展,應用支架材料和種子細胞來修復周圍神經(jīng)損傷已經(jīng)日趨成熟。骨髓間充質(zhì)干細胞(bone marrow stromal cells,BMSC)作為成體干細胞的一種具有多向分化、增殖迅速、長期存活和低免疫原性的特點,可用于神經(jīng)損傷時組織工程化的種子細胞[1]。目前有許多可降解的人工材料已經(jīng)應用到研究當中,例如聚乳酸、殼聚糖和聚羥基乙酸等,但是同種異體脫細胞神經(jīng)細胞外基質(zhì)材料(acellular extracellular matrix,AECM)作為有仿生性的神經(jīng)替代物,更具有良好的仿生性、組織相容性和低免疫原性,移植后為軸突再生提供適宜的微環(huán)境,能夠有效促進神經(jīng)再生[2,3]。本研究利用組織工程學的方法修復神經(jīng)損傷,觀察種植BMSC的脫細胞支架修復大鼠坐骨神經(jīng)缺損過程中VEGF、S-100蛋白表達及超短波(ultrashortwave,USW)治療對VEGF表達的影響。

    1 材料與方法

    1.1 實驗動物及藥品

    Wistar成年大鼠60只,體質(zhì)量為200~250 g,雌雄不限。均由中國醫(yī)科大學實驗動物部提供。Triton X-100(Sigma公司)、脫氧膽酸鈉(華美生物工程公司)、胰酶(Sigma公司)、抗 S-100抗體(Sigma公司)、抗VEGF抗體(美國Santa Cruze公司)、FITC(美國Santa Cruze公司)、TRITC(美國Santa Cruze公司),DAPI(美國Roche公司)等。

    1.2 實驗方法

    1.2.1 化學萃取脫細胞方法制備AECM:無菌條件下,取Wistar大鼠坐骨神經(jīng),長度為15 mm,去除神經(jīng)外膜用1號縫合線結扎神經(jīng)段兩端,在無菌蒸餾水低滲浸浴12 h;在4%Triton X-100中消化12 h;在無菌蒸餾水中漂洗3 h;在3%脫氧膽酸鈉中持續(xù)振蕩消化12 h,振蕩速率120次/min;重復上述步驟4個周期。萃取神經(jīng)段在4℃的無菌磷酸鹽緩沖液(pH7.4)中保存?zhèn)溆谩?/p>

    1.2.2 BMSC的分離和培養(yǎng):取Wistar雄性大鼠(20~30 d)3只,10%水合氯醛(0.3 ml/kg)腹腔內(nèi)注射麻醉和無菌操作下,取出雙側的股骨和脛骨用0.01 mol/L PBS清洗后剪下干骺端兩端,用裝有含10%小牛血清達爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)基(Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium,DMEM) 的 5 ml注射器從一側穿入股骨髓腔內(nèi),沖出細胞懸液到50 ml的細胞培養(yǎng)瓶內(nèi),瓶置入37℃,5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中。48 h后換培養(yǎng)液,加新鮮培養(yǎng)基。根據(jù)細胞的形態(tài)和密度(占瓶壁面積60%~80%時)進行傳代。

    1.2.3 神經(jīng)移植:取傳至第3代BMSC,按1×106/ml的接種密度從經(jīng)消毒處理的脫細胞支架的一端注射,然后置于培養(yǎng)皿,按上述培養(yǎng)條件培養(yǎng)72 h備用。實驗鼠分為3組,即DMEM組、支架內(nèi)注射BMSC組和支架內(nèi)注射BMSC后應用超短波治療組(USW組)。大鼠用10%水合氯醛腹腔內(nèi)注射麻醉,手術顯微鏡下暴露坐骨神經(jīng),于梨狀肌下緣5 mm處切除10 mm坐骨神經(jīng),分別將支架與兩斷端神經(jīng)外膜縫合,USW組在術后應用超短波治療,術后第2,4,8和12周分別取出移植部分。

    1.2.4 超短波治療:術后24 h,USW組開始實行超短波治療。超短波治療儀頻率為14.24 MHz,輸出功率為14.24 W,一對4 cm2的圓形電極放置在縫合處皮膚的兩側,距離皮膚1 cm,每日1次,每次7 min,在術后第2,4,8和12周分別取出移植的支架。

    1.2.5 半薄切片甲苯胺藍法染色:光鏡觀察有髓神經(jīng)纖維數(shù)和軸突直徑。

    1.2.6 免疫熒光染色檢測和積分光密度分析:按照不同的時間點在各組中隨機選出2只大鼠并取材,用4%的多聚甲醛固定過夜,第2日用PBS沖洗3遍后置入30%的蔗糖溶液過夜,然后用OCT包埋作冷凍切片厚度為8μm,放置到用多聚賴氨酸包被的載玻片上。冷丙酮固定10 min,PBS洗5 min,0.5%Triton穿孔15 min,PBS漂洗2次,每次5 min,1%BSA封閉30 min,一抗為抗S-100抗體(1∶150稀釋)和抗-VEGF抗體(1∶100稀釋)混合液,或者是抗S-100抗體(1∶150稀釋)和抗-GFAP抗體(1∶100稀釋)孵育,4℃過夜;第2日PBS洗5 min,加二抗FITC(1∶200稀釋)和 TRITC(1∶200稀釋)混合液孵育 40 min,PBS洗 5 min,5μg/ml DAPI染色2 min,封片,熒光顯微鏡鏡下觀察。以計算機圖像分析儀MPIAS-500檢測積分吸光度值。

    1.3 統(tǒng)計學分析

    所有的數(shù)據(jù)使用SPSS13.0軟件進行統(tǒng)計學處理和分析,數(shù)據(jù)以x±s表示,各組間比較采用t檢驗及Wilcoxon秩和檢驗,P<0.05為具有統(tǒng)計學差異。

    2 結果

    2.1 BMSC的評價

    原代培養(yǎng)到3 d時,少許梭形BMSC貼附到瓶壁,另有一定數(shù)量紅細胞懸浮瓶內(nèi)。6~8 d時,單層貼壁的梭形纖維樣細胞明顯增多,并逐漸相互匯合成漩渦樣生長,2周左右,單層貼壁的梭形纖維樣細胞幾乎布滿瓶壁,細胞間隙減少。見圖1。

    2.2 再生神經(jīng)纖維的組織學觀察

    甲苯胺藍染色,顯示單位面積內(nèi)髓鞘化的神經(jīng)纖維和神經(jīng)束膜的數(shù)目隨時間的增加而增多,組間比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),USW組的神經(jīng)纖維數(shù)目最多。見圖2。

    2.3 VEGF、S-100蛋白表達

    脫細胞神經(jīng)支架構成的神經(jīng)再生室為注入的BMSC的分化提供了很好的微環(huán)境。免疫熒光雙標方法顯示,術后不同時間點移植神經(jīng)內(nèi)部的施萬細胞標志物S-100和VEGF在各組均為陽性,但在不同的時間點陽性程度或表達數(shù)量不同,在各組第4周時陽性程度最強(圖3)。統(tǒng)計結果顯示移植后12周再生神經(jīng)的S-100和VEGF積分光密度值在USW組高于其他兩組,且有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表1。

    表1 移植后12周各組再生神經(jīng)的S-100和VEGF的積分光密度值比較(x±s)Tab.1 The integrate optical density(IOD)of S-100 and VEGF in regenerated nerves in the three experimental groups at 12 weeks after surgery(x±s)

    3 討論

    隨著組織工程學的發(fā)展,可降解材料和種子細胞的結合為周圍神經(jīng)損傷的修復帶來了新的解決途徑。脫細胞支架擁有正常神經(jīng)組織完整的基質(zhì)和三維立體結構,提供了有利于再生的組織相容性好、通透性與空隙通道,可促進神經(jīng)再生[4,5]。

    施萬細胞對于軸突再生是必不可少的,在周圍神經(jīng)損傷的修復過程中起核心的作用。在移植施萬細胞到脫細胞支架內(nèi)以促進神經(jīng)再生的實驗中,可以呈現(xiàn)施萬細胞在促進修復中的意義[6]。但是由于施萬細胞在體外分離、培養(yǎng)和擴增問題及其在體內(nèi)異源免疫排斥反應等問題,使其在臨床上的應用受到限制[7,8]。BMSC比較容易從供體中獲得且有較大的可塑性,有多潛能分化能力,可在體外和體內(nèi)被誘導成脂肪、成骨、骨骼肌、心肌、內(nèi)皮和神經(jīng)外胚層等多種細胞。BMSC可被誘導分化為施萬細胞樣細胞,以促進神經(jīng)纖維的生長和神經(jīng)髓鞘的形成[9]。

    VEGF在正常成熟神經(jīng)組織中不表達或少表達,而在許多病理情況下,如缺血、缺氧、外傷、神經(jīng)系統(tǒng)脫髓鞘及代謝等,神經(jīng)組織VEGF及其受體表達顯著增高,這種反應性的增高對受損的神經(jīng)組織起著神經(jīng)保護與營養(yǎng)作用[10]。Hobson 等[11]用硅膠管將坐骨神經(jīng)斷端連接,制成長度為1 cm的再生室模型,局部注入VEGF,發(fā)現(xiàn)10~30 d期間,施萬細胞明顯增殖與遷移,軸突再生也較顯著,且這種作用呈劑量依賴性。VEGF在神經(jīng)再生的過程中起到以下的作用:VEGF刺激神經(jīng)內(nèi)血管與神經(jīng)滋養(yǎng)動脈形成,能為神經(jīng)軸突生長、施萬細胞增生提供所必需的氧分及營養(yǎng)物質(zhì),保持神經(jīng)微環(huán)境的穩(wěn)定;VEGF通過直接作用于神經(jīng)細胞膜上的受體,促進神經(jīng)軸突生長,即VEGF促進神經(jīng)再生是通過其促血管生長與神經(jīng)營養(yǎng)雙重的結合作用。

    本實驗發(fā)現(xiàn)作為施萬細胞的特征性標志物S-100在各組再生的神經(jīng)中有表達,并呈時間依賴性增多,在12周時達到頂峰,其中USW組在各時間點均表達最高。這說明在再生的神經(jīng)內(nèi)有施萬細胞或施萬細胞樣細胞存在。有研究報道這類細胞來源有兩種:一是由于組織微環(huán)境的存在使移植的BMSC在體內(nèi)被誘導為施萬細胞樣細胞,從而分泌神經(jīng)生長所需的因子促進神經(jīng)再生[12];二是這些細胞來自于損傷殘端的近側,自身的施萬細胞遷移到支架內(nèi)進而參與神經(jīng)的再生過程。本實驗經(jīng)雙標發(fā)現(xiàn)VEGF與S-100共存于施萬細胞,表明該細胞也能分泌VEGF,而超短波治療可促使其分泌或表達量的增加,從而更好促進神經(jīng)軸突的再生。

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