HPLC法測定金頂側(cè)耳中延胡索酸的含量

劉佳，樸惠順，施溯筠，張善玉（長白山生物資源與功能分子教育部重點實驗室，延吉市 133000）

金頂側(cè)耳（Pleurotm citrinopileatus Sing.）隸屬于側(cè)耳科（Pleurotaceae）側(cè)耳屬，又稱金頂蘑、榆黃蘑、榆黃菇、玉皇蘑，是一種富含蛋白質(zhì)、氨基酸和維生素等多種營養(yǎng)成分的食藥用菌[1，2]?，F(xiàn)代研究表明，其還含有延胡索酸、D-甘露醇、麥角甾醇、洛伐他汀和多糖等生物活性成分[3，4]。其中，延胡索酸具有抗腫瘤、抗菌、抗電休克、鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)咳、平喘等活性[2]。目前，對金頂側(cè)耳中延胡索酸含量測定方法的報道較少。因此，筆者采用高效液相色譜（HPLC）法測定了金頂側(cè)耳中延胡索酸的含量，以期為金頂側(cè)耳的質(zhì)量控制提供試驗基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 儀器

HPLC儀，包括LC-10ATvp泵、SPD-10Avp紫外檢測器、AT-330柱溫箱（日本島津公司）；N2000色譜工作站（浙江大學(xué)智達(dá)信息工程有限公司）；KQ2200型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲波儀器有限公司）。

1.2 試藥

延胡索酸標(biāo)準(zhǔn)品（德國Augsburg公司，批號：20071129）；金頂側(cè)耳為吉林省關(guān)東大嫂食品有限公司（Ⅰ）、吉林省撫松華冠參茸有限公司（Ⅱ）、集安市新開河有限公司（Ⅲ）、吉林延邊參茸工貿(mào)有限公司（Ⅳ）和延邊豐義土特產(chǎn)有限公司（Ⅴ）產(chǎn)品，由延邊大學(xué)劉永鎮(zhèn)教授鑒定均為金頂側(cè)耳P.citrinopileatus Sing.的干燥子實體；甲醇為色譜純，水為重蒸餾水，其它試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：大連依利特C18（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動相：甲醇-0.01 mol·L-1磷酸二氫鉀溶液（5∶95，用磷酸調(diào)pH 2.5）；流速：1.0 mL·min-1；檢測波長：216 nm；柱溫：25 ℃。色譜見圖1。

圖1 高效液相色譜圖A.延胡索酸標(biāo)準(zhǔn)品；B.供試品Fig 1 HPCLchromatogramsA.standard fumaric acid；B.test sample

2.2 溶液的制備

2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)品溶液：精密稱取延胡索酸標(biāo)準(zhǔn)品適量，加無水乙醇溶解，制成每1 mL含80 μg的溶液，即得。

2.2.2 供試品溶液：取金頂側(cè)耳子實體，60℃下干燥4 h，粉碎過40目篩，精密稱取藥粉0.5 g，加60%乙醇20 mL，超聲處理30 min，放冷，轉(zhuǎn)移至25 mL容量瓶中，用60%乙醇稀釋至刻度，搖勻，靜置，上清液用0.45μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.3 線性關(guān)系考察

分別精密吸取標(biāo)準(zhǔn)品溶液（80 μg·mL-1）2、5、10、15、20μL，注入液相色譜儀，按上述色譜條件測定峰面積積分值。以進(jìn)樣量（X，ng）為橫坐標(biāo)，峰面積積分值（Y）為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得回歸方程為Y＝3511.9X－66841（r＝0.9999）。結(jié)果表明，延胡索酸進(jìn)樣量在0.6～1.6 μg范圍內(nèi)與峰面積積分值呈良好線性關(guān)系。

2.4 精密度試驗

取同一標(biāo)準(zhǔn)品溶液，按上述色譜條件重復(fù)進(jìn)樣5次，測定峰面積。結(jié)果，RSD＝0.88%，表明儀器精密度較好。

2.5 穩(wěn)定性試驗

精密吸取供試品溶液10 μL，分別于0、2、4、6、8、10、12、24 h各測定1次峰面積。結(jié)果，RSD＝1.75%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.6 重復(fù)性試驗

取同一批樣品6份，分別按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，按上述色譜條件測定。結(jié)果，延胡索酸的含量分別為0.44%、0.44%、0.45%、0.44%、0.44%和0.43%，平均含量為0.44%，RSD＝1.53%，表明方法重復(fù)性良好。

2.7 加樣回收率試驗

取已知含量的同一批樣品6份，精密稱取0.25 g，分別加入一定量的延胡索酸標(biāo)準(zhǔn)品，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，計算樣品含量及加樣回收率，結(jié)果見表1。

表1 加樣回收率試驗結(jié)果（n＝6）Tab 1 Results of recovery test（n＝6）

2.8 樣品含量測定

取5批樣品，經(jīng)干燥、粉碎后分別按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液。精密吸取供試品溶液，進(jìn)樣10μL，用峰面積外標(biāo)法測定含量。結(jié)果，樣品Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ中延胡索酸含量分別為0.64%、0.47%、0.53%、0.38%、0.44%。

3 討論

本試驗分別以無水乙醇、80%乙醇、60%乙醇和40%乙醇作為提取溶劑平行操作。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，60%乙醇和40%乙醇的提取效果相對較高且相差不大，但40%乙醇提取出的水溶性雜質(zhì)較多，故選用60%乙醇為提取溶劑。

取樣品粉末適量，精密稱定，分別加入60%乙醇，采用不同時間（15、30、60 min）超聲提取樣品，考察提取時間。結(jié)果表明，提取30 min和60 min的含量基本一致，故采用超聲提取30 min。

筆者曾試用乙腈-0.4%磷酸二氫鉀溶液（20∶80，用磷酸調(diào)pH 2.5）[5]、乙腈-0.4%磷酸二氫鉀溶液（10∶90，用磷酸調(diào)pH 2.5）、乙腈-0.4%磷酸二氫鉀溶液（5∶95，用磷酸調(diào)pH 2.5）、甲醇-0.01 mol·L-1磷酸二氫鉀溶液（20∶80，用磷酸調(diào)pH 2.5）[6]、甲醇-0.01 mol·L-1磷酸二氫鉀溶液（10∶90，用磷酸調(diào)pH 2.5）和甲醇-0.01 mol·L-1磷酸二氫鉀溶液（5∶95，用磷酸調(diào)pH 2.5）6種流動相，結(jié)果以甲醇-0.01 mol·L-1磷酸二氫鉀溶液（5∶95，用磷酸調(diào)pH 2.5）為流動相，延胡索酸出峰時間適中（約9.5 min），與周圍雜質(zhì)峰分離較好，且節(jié)約了價格較貴的色譜甲醇的用量，降低了成本，故選用該流動相進(jìn)行試驗。

本試驗建立的以HPLC法測定金頂側(cè)耳中延胡索酸含量的方法，簡便、準(zhǔn)確、重復(fù)性好。對長白山地區(qū)5個不同生產(chǎn)公司的樣品進(jìn)行測定的結(jié)果表明，不同金頂側(cè)耳干燥子實體中延胡索酸含量在0.38%～0.64%之間，含量差異較小。因金頂側(cè)耳的產(chǎn)地除長白山地區(qū)外，還有黑龍江、遼寧、河北、廣東、西藏等地[7]，而此次所測定的金頂側(cè)耳僅為長白山地區(qū)采集，因此有必要作進(jìn)一步研究，以確定更為合理的含量限度范圍。

[1]謝福泉，羿 紅，蘭家細(xì)，等.金頂側(cè)耳子實體營養(yǎng)成分分析[J].食用菌學(xué)報，2007，14（2）：81.

[2]張 影，包海鷹，李 玉.珍貴食藥用菌金頂側(cè)耳研究現(xiàn)狀[J].吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2003，25（1）：54.

[3]包海鷹，張 影，圖力古爾，等.金項側(cè)耳化學(xué)成分的研究[J].菌物學(xué)報，2004，23（2）：262.

[4]劉賢銘.真菌多糖的抗腫瘤研究及臨床應(yīng)用評價[J].中國藥房，2006，17（8）：629.

[5]廖建春.高效液相色譜法測定七葉蓮膠囊中延胡索酸的含量[J].藥學(xué)與臨床研究，2007，15（5）：421.

[6]游勇基，程廣強(qiáng).HPLC法測定腫節(jié)風(fēng)中延胡索酸的含量[J].中國中藥雜志，1997，22（9）：554.

[7]圖力古爾，李 玉.我國側(cè)耳屬真菌的種類資源及其生態(tài)地理分布[J].中國食用菌，2001，20（5）：8.