豬繁殖與呼吸綜合征病毒TM株的分離鑒定及其Nsp2序列分析

鄧雨修，招麗嬋，蘇潤(rùn)環(huán)，潘永飛，楊明柳，吳德銘，李春梅，宋延華

(廣東溫氏食品集團(tuán)有限公司溫氏研究院，廣東 新興 527400)

豬繁殖與呼吸綜合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)是由PRRS病毒(PRRSV)引起的一種嚴(yán)重危害養(yǎng)豬業(yè)的病毒性傳染病，其臨床癥狀主要表現(xiàn)為母豬繁殖障礙和仔豬呼吸系統(tǒng)疾病。該病自1987年美國(guó)首次報(bào)道以來(lái)，世界上很多國(guó)家都有相繼報(bào)道[1-3]。郭寶清等于1996年首次在國(guó)內(nèi)分離到PRRSV，證實(shí)了該病在中國(guó)的存在[4]。自2006年夏季以來(lái)，高致病性PRRSV變異株引起的PRRS的暴發(fā)與流行，給我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失[5]。對(duì)分離的PRRSV全基因序列測(cè)序分析表明，病原的基因序列變化主要是在Nsp2區(qū)缺失了30個(gè)氨基酸，其中僅在一段基因序列中就連續(xù)缺失了29個(gè)氨基酸[6-8]。本研究在臨床流行病學(xué)研究的基礎(chǔ)上，分離病毒，經(jīng)基因序列分析及人工豬體感染發(fā)病試驗(yàn)，鑒定為新缺失表型高致病性PRRSV美洲型毒株，補(bǔ)充和豐富了毒株的基因組信息數(shù)據(jù)，為深入開展該毒株的遺傳變異分析及生物學(xué)特性研究奠定了基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 病毒株及主要試劑 PRRSV TM分離株由本實(shí)驗(yàn)室分離并保存；PRRSV TP變異株為本實(shí)驗(yàn)室分離、鑒定并保存(EU864233)；Ingelvac PRRS MLV為Boehringer Ingelheim公司產(chǎn)品；Marc-145細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室保存；pMD18-T、TOP10菌株、PrimeSTAR?HS DNA Polymerase、PrimeScriptTMReverse Transcriptise(RNase H-)、DNA Marker DL15000 購(gòu) 自TaKaRa公司；TRIzol Reagent購(gòu)自Invitrogen公司。

1.2 引物設(shè)計(jì) 參照GenBank中登錄的Ingelvac PRRS MLV(AF066183）、TP(EU864233)等毒株基因序列及蘇潤(rùn)環(huán)等發(fā)表的序列[9]，設(shè)計(jì)三對(duì)引物(表1)，由寶生物工程(大連)有限公司合成。

表1 PRRSV Nsp2基因檢測(cè)及鑒別擴(kuò)增引物Table 1 Primes of detection and identification the PRRSV Nsp2 gene

1.3 病料的采集與處理 參照文獻(xiàn)[10]方法進(jìn)行。

1.4 病毒分離 病毒懸液上清接種單層Marc-145細(xì)胞，37℃吸附1 h后，用含2%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)5 d～7 d，當(dāng)70%～80%出現(xiàn)細(xì)胞病變(CPE)時(shí)收集病毒液并盲傳3代。將分離病毒液按Reed-Muench法測(cè)定其TCID50。

1.5 病毒分離株的RT-PCR鑒定 采用P1/P2和P3/P4兩對(duì)引物，按照兩步法進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，其中反應(yīng)參數(shù)為：42℃ 45 min，95℃ 5 min，獲得cDNA。以cDNA為模板，94℃ 2 min；94℃30 s、55℃1 min、72℃1 min，30個(gè)循環(huán)；72℃10 min。

1.6 Nsp2基因的序列測(cè)定及分析 以引物P5/P6，擴(kuò)增Nsp2基因的目的片段，進(jìn)行回收、連接和轉(zhuǎn)化，鑒定正確的質(zhì)粒由TaKaRa公司測(cè)序，使用DNAStar軟件和NCBI BLAST在線分析測(cè)序結(jié)果，并與國(guó)內(nèi)外主要PRRSV分離株的相應(yīng)序列進(jìn)行核苷酸和氨基酸比較分析。

1.7 病毒豬體回歸試驗(yàn) 將16頭3周齡左右PRRSV抗體及病原檢測(cè)均為陰性的健康仔豬隨機(jī)平均分為2組，第一組接種TM株第5代病毒，毒價(jià)為TCID5010-5.5/mL；第二組注射正常細(xì)胞液，作為空白對(duì)照。接種方式為頸部肌肉注射2 mL/頭，滴鼻1 mL。觀察臨床癥狀和體溫變化；對(duì)死亡豬及時(shí)剖解，存活豬于接種后14 d解剖，觀察病理變化，具體操作參照文獻(xiàn)[11-12]進(jìn)行。

2 結(jié)果

2.1 RT-PCR鑒定 用引物P1/P2，擴(kuò)增血清樣品和組織懸液。擴(kuò)增出約為500 bp的特異片段(圖1)，與PRRSV變異株片段大小接近；而P3/P4引物擴(kuò)增產(chǎn)物與PRRSV TP變異株相比較片段略小(圖2)。

2.2 病毒分離 病料在Marc-145細(xì)胞上盲傳3代后，培養(yǎng)至72 h～96 h出現(xiàn)明顯的CPE，表現(xiàn)為細(xì)胞灶狀變圓突起，聚集、皺縮并脫落，與目前國(guó)內(nèi)外報(bào)道的PRRSV所致細(xì)胞病變相似。病毒TCID50達(dá)107/mL左右。將分離株病毒暫定名為TM株。

2.3 TM株Nsp2基因的克隆 利用RT-PCR方法擴(kuò)增TM株Nsp2基因片段進(jìn)行T克隆和鑒定。TM株Nsp2基因重組質(zhì)粒經(jīng)PCR和測(cè)序鑒定，大小為2844 bp，與預(yù)測(cè)相符。

2.4 Nsp2基因的核苷酸序列分析 通過(guò)序列測(cè)定獲得TM株Nsp2序列，核酸序列比對(duì)分析結(jié)果表明，TM株Nsp2基因序列與目前國(guó)內(nèi)分離的PRRSV變異株相比同樣存在2780 bp～2782 bp位置3個(gè)核苷酸和2933 bp～3019 bp位置87個(gè)核苷酸的缺失。此外，TM毒株在1401 bp～1463 bp位置發(fā)現(xiàn)有63個(gè)核苷酸的獨(dú)特缺失，該缺失現(xiàn)象與目前國(guó)內(nèi)分離的PRRSV變異株缺失表型不完全一致，具有毒株特異性。

Nsp2核苷酸序列同源性分析表明，本實(shí)驗(yàn)分離的TM株與國(guó)內(nèi)分離的高致病性PRRSV毒株GD、HEB1、Henan-1、JXA1、HUB1、HUB2、HuN、Jiangxi-3、JXA1、NM1、TJ和TP的序列同源性較高，為98.0%～98.6%；而與國(guó)內(nèi)分離的毒株SHB、CH-1R和JA142同源性次之；與NVSL 97-7895株、美洲標(biāo)準(zhǔn)株VR-2332和疫苗株MLV和的同源性相對(duì)較低，分別為87.9%、83.0%和82.9%。系統(tǒng)發(fā)育樹分析表明(圖3)，TM株Nsp2序列與GD、JXA1、TP TJ和HEB1序列接近，類聚于同一分支，與國(guó)內(nèi)早期分離的PRRSV經(jīng)典株SHB、CH-1R株相對(duì)較遠(yuǎn)，與美洲經(jīng)典株VR-2332、疫苗株MLV、NVSL 97-7895和JA142的遺傳距離最遠(yuǎn)。

2.5 TM株Nsp2基因的推導(dǎo)氨基酸序列分析 利用DNAStar軟件對(duì)TM分離株Nsp2基因推導(dǎo)氨基酸序列比對(duì)結(jié)果表明TM株與目前國(guó)內(nèi)外分離的PRRSV毒株相比變異較大，分別存在不同位置的多位點(diǎn)缺失。與經(jīng)典的PRRSV株相比，TM株分別在481位和532位～560位氨基酸存在30個(gè)氨基酸缺失(圖4)，與國(guó)內(nèi)近年來(lái)分離的高致病性PRRSV分離株的缺失表型相同。此外，TM株分別在22位～42位氨基酸存在21個(gè)氨基酸的獨(dú)特缺失(圖4)，目前未見以上兩個(gè)缺失位點(diǎn)表型的報(bào)道。

2.6 病毒豬體回歸試驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)組豬只接種PRRSV TM株后24 h即出現(xiàn)臨床癥狀。主要表現(xiàn)為體溫升高快，接種后第2 d體溫升至40℃以上，第3 d～13 d高達(dá)41℃以上，并逐漸出現(xiàn)食欲減退、精神沉郁、眼結(jié)膜變紅腫脹、全身皮膚發(fā)紅以及神經(jīng)癥狀等。解剖可見全身淋巴結(jié)腫脹，肺臟實(shí)質(zhì)性病變，病變面積占整個(gè)肺部的30%～80%。而對(duì)照組豬體溫均正常，無(wú)臨床癥狀變化。

3 討論

PRRSV各分離株間基因組存在廣泛的變異。尤其以Nsp2序列變異最大，并且具有耐受堿基插入或缺失的能力[13]。高志強(qiáng)等對(duì)PRRSV毒株HB2(sh)/2002全基因序列測(cè)定分析，首次發(fā)現(xiàn)PRRSV存在缺失變異現(xiàn)象，該毒株Nsp2存在連續(xù)編碼12個(gè)氨基酸的36個(gè)核苷酸的缺失[14]。此后一系列PRRSV分離株Nsp2片段的突變、缺失、插入現(xiàn)象相繼被發(fā)現(xiàn)[15]。因而對(duì)Nsp2基因的變異表型分析可反映整個(gè)病毒基因組序列的變異情況[16]。

本研究通過(guò)PRRSV TM分離株的Nsp2基因序列的系統(tǒng)進(jìn)化比較顯示該毒株與近年來(lái)發(fā)現(xiàn)并流行的高熱病毒株的同源性較高，同屬于一個(gè)亞型；而國(guó)內(nèi)SHB、CH-1R和JA142等與美國(guó)疫苗株Resp PRRS MLV遺傳距離較遠(yuǎn)，屬于另一個(gè)亞型。結(jié)合系統(tǒng)進(jìn)化樹分析結(jié)果，可以推斷本研究中分離的TM毒株在流行過(guò)程中其Nsp2基因發(fā)生了不同程度的變異，起源可能與TP、JXA1、GD、TJ和HEB1有關(guān)。特別是與TP株的同源性比其他毒株高，推導(dǎo)氨基酸同源性為98.2%。Nsp2推導(dǎo)的氨基酸序列比較發(fā)現(xiàn)，TM株除了在481位和532位～560位缺失30個(gè)氨基酸外，還在22位～42位氨基酸存在21個(gè)氨基酸的獨(dú)特缺失。TM毒株存在新的缺失位點(diǎn)，與我國(guó)多個(gè)地區(qū)高致病性PRRSV分離株的核苷酸/氨基酸序列均差異較大，表明PRRSV Nsp2基因在缺失變異毒株間存在一定的差異，毒株變異可能與時(shí)間、病毒株間的流行地域跨度、不同毒株在同一宿主的共存競(jìng)爭(zhēng)等密切相關(guān)。

M株是在廣東地區(qū)某疑似PRRSV感染的豬場(chǎng)病料中分離得到。在Marc-145細(xì)胞盲傳3代即可產(chǎn)生明顯穩(wěn)定的CPE，與國(guó)內(nèi)2006年后分離的高致病性PRRSV變異株的感染細(xì)胞特性相似。動(dòng)物回歸試驗(yàn)結(jié)果顯示，TM株接種仔豬可引起明顯臨床癥狀和病理變化，表明該毒株具有較強(qiáng)的致病性。

盡管目前對(duì)Nsp2基因的功能尚不清楚，但普遍認(rèn)為PRRSV Nsp2基因的功能與病毒的細(xì)胞嗜性、復(fù)制與生長(zhǎng)、致病性等密切相關(guān)[13]。有研究表明，Nsp2基因中30個(gè)氨基酸片段的缺失并非與病毒的毒力相關(guān)[17]。本研究中TM分離株在30個(gè)氨基酸缺失的基礎(chǔ)之上再次發(fā)生了21個(gè)氨基酸的獨(dú)特缺失，由此表明PRRSV流行毒株的Nsp2基因序列發(fā)生了新變化，該缺失變異是否與毒株的毒力、生長(zhǎng)特性等生物學(xué)特征相關(guān)，尚需進(jìn)一步研究。

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