三種倍半萜類化合物體外抗腫瘤細胞增殖活性研究

于 峰,王思明,董 玫,倪志宇,董富潔,史清文*,鈴木信夫,叢 斌

1河北醫(yī)科大學(xué)法醫(yī)學(xué)系河北省法醫(yī)學(xué)重點實驗室,石家莊 050017;2河北醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院,石家莊 050017;3千葉大學(xué)醫(yī)學(xué)部環(huán)境影響生物化學(xué)教室,千葉市

菊科是有花植物中最大的科,含有 1100多個屬,23000～25000多種植物,很多菊科植物在各國民間藥用。土木香(Inula helenium)系菊科旋覆花屬植物,為多年生草本,其根供藥用,具有健胃、利尿、祛痰和驅(qū)蟲等功效[1]。性溫,味辛、苦。在我國分布于新疆,其它許多地區(qū)常栽培。藥理活性研究發(fā)現(xiàn)土木香內(nèi)酯類成分有抗腫瘤細胞增殖作用和抗結(jié)核分支桿菌等作用[2,3]。旋覆花(Inula japonica)為菊科旋覆花屬植物,是多年生直立草本植物,主要分布于我國的東北、華北、西北及浙江、江蘇、四川和廣東等地區(qū)[1]。近年研究表明旋覆花的主要成分為倍半萜內(nèi)酯類化合物,藥理活性方面有細胞毒性和抗微生物等報道[4,5]。本文對從土木香的根中和旋覆花得花中分離得到的三種主要倍半萜內(nèi)酯化合物異土木香內(nèi)酯(1)[6],1-氧-乙酰大花旋覆花內(nèi)酯(2)[7]和大花旋覆花內(nèi)酯(3)[7]進行了體外抗腫瘤細胞增殖活性的實驗,初步探討了這三種化合物結(jié)構(gòu)與活性之間的構(gòu)效關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 試驗藥物

三種倍半萜類化合物:異土木香內(nèi)酯(1),1-氧-乙酰大花旋覆花內(nèi)酯(2)和大花旋覆花內(nèi)酯(3)由史清文教授分別從菊科旋覆花屬土木香(Inula helenium)的根中和旋覆花(Inula japonica)的花中分離得到,均為白色針晶,經(jīng)核磁共振光譜和質(zhì)譜確定它們的結(jié)構(gòu)如下(1～3),純度 99%。

1.2 藥品和試劑

噻唑藍(MTT,Sigma,M-2128);RPMI 1640培養(yǎng)基(GIBCO);胰蛋白酶(GIBCO);胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司);順鉑(Sigma,034k3693)。

1.3 細胞系和培養(yǎng)條件

試驗用腫瘤細胞株由日本千葉大學(xué)醫(yī)學(xué)部第二生物化學(xué)教室提供。U251SP:人腦神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞株[8];HLE:人肝癌細胞株[8];MM1-CB:人黑色素瘤細胞株[8];KT:人乳腺癌腦轉(zhuǎn)移腫瘤細胞株[8]。試驗用正常細胞由河北醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院細胞生物學(xué)實驗室提供。HELF:正常人胚肺成纖維細胞。各腫瘤細胞株接種于直徑為 100mm的培養(yǎng)皿中,加入含 10%胎牛血清的 RPMI 1640培養(yǎng)基,37℃和5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.4 方法

參照文獻[9]中的方法。將被試細胞懸浮接種于 96孔板,每孔 90μL(含 1×104個細胞),分別加入磷酸鹽緩沖液(PBS)、溶劑對照(終濃度 0.5%DMSO)、陽性對照順鉑和終濃度為 100、10和 1 μmol/L的化合物 1～3各 10μL,每組均設(shè) 3復(fù)孔,置于飽和濕度、37℃和 5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 72 h。于培養(yǎng)結(jié)束前 4 h,各培養(yǎng)孔加入 5mg/mL四氮唑鹽 (MTT)10μL,用酶聯(lián)免疫檢測儀測定各孔吸光度值(OD值),測定波長 λ=570 nm,參考波長 λ=630 nm,并計算細胞增殖抑制率,細胞增殖抑制率(%)=(1-OD對照組/OD實驗組)×100%。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理

數(shù)據(jù)用 x±s表示;兩組間數(shù)據(jù)用 t-檢驗,多組間數(shù)據(jù)用單因素方差分析。應(yīng)用 SAS612統(tǒng)計軟件計算。

2 結(jié)果

2.1 化合物 1～3對體外培養(yǎng)的 U251SP細胞增殖的抑制作用

結(jié)果如圖 1所示,陽性對照順鉑顯示較強的抑制人腦神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞(U251SP)增殖活性的作用,1、10和 100μmol/L順鉑處理 U251SP細胞后,腫瘤細胞抑制率分別為 24.62、47.71和 69.99;化合物 1用相同的劑量處理 U251SP細胞后,其腫瘤細胞增殖抑制率與順鉑幾乎相同,分別為 21.48、54.56和72.20,并且與空白對照組相比較極顯著性差異,提示化合物 1有較強的抑制 U251SP細胞增殖的作用。通過腫瘤細胞增殖抑制率對順鉑和化合物 1濃度的對數(shù)回歸方程 y=9.8521lnx+24.755和 y=11.014lnx+24.053,得到順鉑和化合物 1對U251SP細胞增殖的半數(shù)抑制濃度(IC50)分別為12.97和 10.55μmol/L。化合物 2和 3對 U251SP細胞的增殖不顯示抑制活性。

圖 1 三種倍半萜內(nèi)酯化合物對人腦神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞增殖的影響Fig.1 Effect of three compounds on the proliferation of U251SP tumor cell line

2.2 化合物 1～3對體外培養(yǎng)的人肝癌細胞增殖的抑制作用

結(jié)果如圖 2所示,陽性對照順鉑對人肝癌細胞(HLE)增殖幾乎不顯示抑制活性,即使用 100 μmol/L順鉑處理 HLE細胞,其腫瘤細胞抑制率僅為 14.01%,而用 1、10和 100μmol/L的化合物 1處理 HLE細胞后,其腫瘤細胞抑制率分別為 21.42、36.56和 64.13,與空白對照組相比較極顯著性差異,并且呈現(xiàn)較好的劑量以來關(guān)系,提示化合物 1有較強的抑制 HLE細胞增殖的作用?；衔?2只在100μmol/L劑量組顯示較強的腫瘤細胞增殖抑制活性,其腫瘤細胞增殖的抑制率為 55.67,而化合物3對 HLE細胞的增殖不顯示抑制活性。

圖 2 三種倍半萜內(nèi)酯化合物對人肝癌細胞增殖的影響Fig.2 Effect of three compounds on the proliferation of HLE tumor cell line

2.3 化合物 1～3對體外培養(yǎng)的人黑色素瘤細胞增殖的抑制作用

結(jié)果如圖 3所示,陽性對照順鉑對人黑色素瘤細胞(MM 1-CB)增殖幾乎不顯示抑制活性,即使用100μmol/L順鉑處理 MM 1-CB細胞,其腫瘤細胞抑制率僅為 8.98%,而用 1、10和 100μmol/L的化合物 1處理 MM1-CB細胞,其腫瘤細胞增殖抑制率分別為 13.77、61.44和 87.03,與空白對照組相比較極顯著性差異,并且呈現(xiàn)較好的劑量以來關(guān)系,提示化合物 1有較強的抑制 MM1-CB細胞增殖的作用。化合物 2只在 100μmol/L劑量組顯示中等程度的腫瘤細胞增殖抑制活性,其腫瘤細胞增殖抑制率為39.13,而化合物 3對 MM1-CB細胞的增殖不顯示抑制活性。

圖 3 三種倍半萜內(nèi)酯化合物對人黑色素瘤細胞增殖的影響Fig.3 Effectof three compounds on the proliferation of MM 1-CB tumor cell line

2.4 化合物 1～3對人乳腺癌腦轉(zhuǎn)移腫瘤細胞增殖抑制活性的影響

陽性對照順鉑對人乳腺癌腦轉(zhuǎn)移腫瘤細胞(KT)的增殖顯示較強的抑制活性,IC50僅為 6.26 μmol/L,而化合物 1對 KT細胞的增殖顯示中等程度的抑制活性,IC50為 48.52μmol/L,化合物 2和 3對 KT細胞增殖不顯示抑制活性,IC50均大于 100 μmol/L。

2.5 化合物 1～3對人胚肺成纖維細胞增殖抑制活性的影響

實驗結(jié)果如圖 4所示,陽性對照順鉑對人胚肺成纖維細胞(HELF)的增殖呈現(xiàn)較強的抑制活性,IC50為 16.89μmol/L,化合物 1僅在 100μmol/L劑量組顯示較低的細胞增殖抑制活性,其細胞增殖抑制率為 22.54,其它兩種試驗用化合物對 HELF細胞的增殖不顯示抑制活性,三種被試化合物的 IC50均大于 100μmol/L。

圖 4 三種倍半萜內(nèi)酯化合物對人胚肺成纖維細胞增殖的影響Fig.4 Effect of three compounds on the proliferation of Human embryonic lung fibroblast

3 討論

癌癥是威脅人類健康的一大兇手,是僅次于心腦血管疾病的第二大致死性疾病(如果將心血管疾病和腦血管疾病分開統(tǒng)計,癌癥則位于第一位),嚴重地威脅人類的健康和生命?，F(xiàn)在臨床上應(yīng)用的抗癌藥物雖然種類不少,但價格昂貴,毒副作用嚴重,且尚沒有治療某些癌癥的特效藥。因此尋找療效確切,作用機理清楚,治愈率高,毒副作用小的抗癌藥物,攻克癌癥成為全世界醫(yī)藥工作者亟待解決的一大課題。植物在其漫長的進化過程中合成了許許多多結(jié)構(gòu)各異的次生代謝天然產(chǎn)物,這些次生代謝產(chǎn)物不僅具有不同的生物活性,還常常被發(fā)現(xiàn)有新的作用機制,象紫杉醇(Taxol·)、長春新堿(Vincristine,VCR)、喜樹堿(Camptothecin,CPT)就是從植物中發(fā)現(xiàn)的三個優(yōu)秀的天然抗癌藥物中的代表,但彼此具有三個不同的甚至完全相反的抗癌作用機制,這些天然藥物的發(fā)現(xiàn)和在臨床上的廣泛應(yīng)用,極大地推動了化學(xué)家和藥學(xué)家對抗癌藥物的研發(fā),并極大地促進了病理學(xué)家和生物學(xué)家對抗癌作用機理的研究[10,11]。據(jù)統(tǒng)計,目前使用的化學(xué)藥物中,30%以上是天然化合物經(jīng)結(jié)構(gòu)修飾產(chǎn)生的,而臨床上應(yīng)用的抗癌藥物 74%來源于天然產(chǎn)物和天然產(chǎn)物的衍生物或是因受天然產(chǎn)物結(jié)構(gòu)的啟發(fā)而設(shè)計的合成藥物。從包括植物在內(nèi)的自然界中尋找發(fā)現(xiàn)高效低毒的抗癌活性成分或先導(dǎo)化合物一直是國內(nèi)外藥物學(xué)家十分關(guān)注的課題和研究的熱點[12-29]。用中草藥治療癌癥在我國有著悠久的歷史和豐富的臨床經(jīng)驗,用現(xiàn)代的方法研究其活性成分及其作用機制是發(fā)現(xiàn)新的先導(dǎo)化合物研制開發(fā)新型抗癌藥物的一條捷徑。

菊科旋覆花屬植物含有豐富的倍半萜內(nèi)酯類化合物,很多倍半萜內(nèi)酯類化合物都顯示有不同程度的抗腫瘤活性。楊超等于 2003年報道了旋覆花地上部分的倍半萜內(nèi)酯類成分對腫瘤細胞 SMMC-7721以及 HO-8910具有細胞毒作用[4]。

本實驗研究結(jié)果顯示,三個倍半萜內(nèi)酯類化合物中,異土木香內(nèi)酯對人腦神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞、肝癌細胞、人黑色素瘤和人乳腺癌腦轉(zhuǎn)移腫瘤細胞的增殖均有明顯的抑制作用,對于正常的細胞,即人胚肺成纖維細胞的增殖不呈現(xiàn)抑制活性,而 1-氧-乙酰大花旋覆花內(nèi)酯僅在 100μmol/L的高濃度下,對人肝癌細胞和人黑色素瘤細胞的增殖顯示中等程度的抑制活性,大花旋覆花內(nèi)酯對人腦神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞、肝癌細胞、人黑色素瘤和人乳腺癌腦轉(zhuǎn)移腫瘤細胞的增殖不顯示任何抑制活性。從結(jié)構(gòu)上分析異土木香內(nèi)酯(1)屬于桉葉烷型(Eudesmane)倍半萜內(nèi)酯,A環(huán)和 B環(huán)呈反式聚合,7,8位含有一個 α,β-不飽和的五員內(nèi)酯環(huán)。1-氧-乙酰大花旋覆花內(nèi)酯(2)和大花旋覆花內(nèi)酯(3)都屬于 1,10-開環(huán)的桉葉烷型(1,10-Seco-eudesmane)倍半萜內(nèi)酯,二者在 5位均有一個含有 5個碳原子的側(cè)鏈,由此推測 A環(huán)開環(huán)可能是導(dǎo)致 1-氧-乙酰大花旋覆花內(nèi)酯(2)和大花旋覆花內(nèi)酯(3)對人腦神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞、肝癌細胞、人黑色素瘤和人乳腺癌腦轉(zhuǎn)移腫瘤細胞的增殖不顯示抑制活性的原因。

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