黃鰭金槍魚頭蛋白酶解液及分級組分對小鼠脾淋巴細胞增殖的影響

楊 萍,蔡本利,洪鵬志

水產品深加工廣東普通高校重點實驗室廣東海洋大學食品科技學院,廣東湛江 524088

金槍魚是遠洋漁業(yè)的重要經濟魚類,作為一種深海魚類,金槍魚肉質鮮美,營養(yǎng)全面,是現(xiàn)代人喜愛的美食。研究表明,金槍魚保健功能顯著,具有防止動脈硬化,保護肝臟、治療貧血多方面的功效[1],其加工產品附加值非常高。目前,金槍魚除少部分冰鮮銷售外,一般都經冷凍制成冷凍金槍魚肉,通常都用來制成魚生、壽司、調味或罐裝食品。金槍魚加工過程中會出現(xiàn)大量的下腳料,包括魚頭、內臟、鰓、魚皮等,產生的下腳料大約占總重量的 50% ～70%,下腳料中含有大量的蛋白質,脂肪、礦物質及多種生物活性物質,是值得開發(fā)利用的資源。海洋生物是研究開發(fā)功能性活性物質的良好資源。目前,海洋生物中免疫活性物質的研究主要集中在貝類,有牡蠣提取物[2]、扇貝多肽[3]、文蛤提取物[4]、鮑魚酶解提取物[5]等,海洋魚類來源的免疫活性物質的研究少見有報道。我們對金槍魚屬中產量最大的黃鰭金槍魚(Thunnus albacares)魚頭的營養(yǎng)成分[6]進行了研究,報道了其蛋白酶解液對小鼠免疫功能的調節(jié)作用[7],本文報道黃鰭金槍魚頭蛋白酶解液及其超濾組分對小鼠脾淋巴細胞增殖作用的影響,旨在探討金槍魚頭蛋白酶解物的免疫調節(jié)活性,為進一步的開發(fā)利用提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

SPF級 Balb/c種小鼠(合格證編號:0016240),雄性,19～21 g,購自廣東省醫(yī)學實驗動物中心;黃鰭金槍魚頭,由廣東省廣遠遠洋漁業(yè)集團有限公司提供(冰柜中冷凍保存);木瓜蛋白酶、中性蛋白酶,購自廣西南寧龐博生物有限公司;RPMI1640培養(yǎng)液,購自北京天潤善達生物科技有限公司;青霉素/鏈霉素(10000 IU/mL),購自中國醫(yī)學科學院生物醫(yī)學工程研究所;新生牛血清,購自杭州四季清生物技術公司產品;MTT,Duchefa產品;刀豆蛋白 A(ConA),Calbiochem產品;二甲基亞砜 (DMSO)、脂多糖(LPS)購自 sigma公司;杯式超濾器購自上海亞東核級樹脂有限公司,酶標儀為 Bio-Rad公司產品。

1.2 方法

1.2.1 黃鰭金槍魚頭蛋白酶解液及分級組分的制備

金槍魚頭熱水浸提后取肉,絞碎,勻漿,按文獻[8]條件進行酶解,100℃水浴滅酶 10min,冷卻后,以 4000 r/m in離心 10 min,棄去上層油脂、雜質和下層沉淀,中間清液即為金槍魚頭蛋白酶解液EPTH(以下簡稱酶解液),酶解液在 0.25 MP壓力下,先后經過截留分子質量為 10、5、3、1 kD的平板膜進行超濾,得到分子量為 10 kD以上、10～5 kD、5～3 kD、3～1 kD、1 kD以下五級組分,將五級組分的蛋白質含量調整與酶解液的濃度一致,于 121℃高溫滅菌后,分別標記為組分Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ,冷藏備用。

1.2.2 淋巴細胞的制備

拉頸處死 Balb/c小鼠,無菌取脾,剪碎研磨后,于 200目篩網上 Hank's沖洗過濾,制成細胞懸液。無菌條件下 1000 r/min離心 5m in,棄上清,加入 2 m L紅細胞裂解液,靜止 5 min裂解紅細胞,1000 r/min離心 5min,棄上清。Hank's液沖洗脾細胞,離心后棄上清,重復 1次,2 mLRPMI1640完全培養(yǎng)液重懸脾細胞,臺盼蘭染色計數,調整其濃度為 4×109/L,活細胞數 ＞95%。

1.2.3 淋巴細胞增殖反應[9]

無菌條件下,向 96孔板中依次加入上述脾細胞懸液 100μL,各組對照孔加完全培養(yǎng)液 4μL,試驗孔加受試樣品 4μL;ConA處理組加 ConA(100mg/L)10μL/孔,LPS處理組加 LPS(200 g/L)10μL/孔,用完全培養(yǎng)液補足每孔體積為 200μL,脾細胞終濃度為 2×109/L。每個處理設 6個復孔,置于 37℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 48 h,培養(yǎng)結束前 4 h,每孔加無菌 MTT(5 g/L)溶液 25μL,振蕩均勻。培養(yǎng)結束后,4000 r/m in離心 5 min,棄上清,每孔加 200μL DMSO終止反應,振蕩均勻,顯色 10 min,用酶標儀在 570 nm波長下測各孔的吸光值(A值),以刺激指數(SI=試驗孔 A值 /對照孔 A值)判斷淋巴細胞轉化程度。

1.2.4 EPTH及分級組分的氮含量的測定

氮含量:半微量凱氏定氮法[10],蛋白質含量 =總氮 ×6.25

1.3 數據統(tǒng)計與處理

所得數據用 Spss13.0軟件處理,結果以 ±s表示,用 LSD檢驗進行顯著性分析。

2 結果

2.1 EPTH及分級組分對小鼠淋巴細胞增殖能力的影響

2.1.1 無有絲分裂原刺激條件下,EPTH及分級組分對小鼠淋巴細胞增殖的影響

由表 1可見,在無有絲分裂原刺激條件下,與對照組相比,組分Ⅵ(酶解液)對小鼠脾淋巴細胞增殖沒有顯著的促進或抑制作用,組分Ⅱ和組分Ⅴ能顯著提高小鼠脾淋巴細胞的增殖活性,并且組分Ⅴ的SI達到 1.93,能非常顯著促進淋巴細胞增殖,與組分Ⅱ相比,差異性極顯著(P＜0.001),其余 3組分對小鼠淋巴細胞增殖有輕微的抑制作用,但無顯著性。

2.1.2 Con A刺激條件下,EPTH及分級組分對小鼠淋巴細胞增殖能力的影響

由表 1可見,與對照組相比,組分Ⅵ對由 Con A誘導的 T淋巴細胞增殖有輕微的抑制作用,但無顯著性;組分Ⅱ和組分Ⅴ對由 ConA誘導的 T淋巴細胞增殖有極顯著的促進作用,而且組分Ⅴ的促進作用更加顯著,與組分Ⅱ相比,差異極其顯著(P＜0.001)。其他組分對 Con A誘導的 T淋巴細胞增殖有輕微的抑制作用,但無顯著性。

2.1.3 LPS刺激條件下,EPTH及分級組分對小鼠淋巴細胞增殖能力的影響

由表 1可見,與對照組相比,EPTH及分級組分的 SI均大于 1,說明均有一定的促進 LPS誘導的 B淋巴細胞增殖的活性,其中,組分Ⅱ和組分Ⅴ對 LPS誘導的 B淋巴細胞增殖有極顯著的促進作用,而且組分Ⅴ的促進作用更加顯著,與組分Ⅱ相比,差異極其顯著(P＜0.001)。EPTH與其余 3組分均無顯著性。

表 1 EPTH及分級組分對小鼠脾淋巴細胞增殖能力的影響±s,n=6)Table 1 Effects of EPTH and its portions onmouse spleen lymphocyte proliferation±s,n=6)

表 1 EPTH及分級組分對小鼠脾淋巴細胞增殖能力的影響±s,n=6)Table 1 Effects of EPTH and its portions onmouse spleen lymphocyte proliferation±s,n=6)

注:任意兩組間,不含相同小寫字母,a、b、c:P＜0.05;不含相同大寫字母,A、B、C:P＜0.01;不含相同字母,E、F、M:P＜0.001。 Note:Between any two groups:a,b,c:P＜0.05;A,B,C:P＜0.01;E,F,M:P＜0.001.

組別Group ConA(-)LPS(-) ConA(+) LPS(+)對照 0.2574±0.0135cFM 0.2868±0.0333cCM 0.2743±0.0217BM組分Ⅰ 0.2433±0.0182cFM(SI=0.95) 0.2432±0.0154dDM(SI=0.85) 0.2990±0.0161BFM(SI=1.09)組分Ⅱ 0.2974±0.0556bF(SI=1.16) 0.3478±0.0189bBF(SI=1.21) 0.3456±0.0173AEF(SI=1.26)組分Ⅲ 0.2196±0.0131cM(SI=0.85) 0.2478±0.0150dCDM(SI=0.86) 0.2935±0.0297BM(SI=1.07)組分Ⅳ 0.2220±0.0188cM(SI=0.86) 0.2632±0.0190cdCDM(SI=0.92) 0.2770±0.0158BM(SI=1.01)組分Ⅴ 0.4962±0.0419aE(SI=1.93) 0.5050±0.0321aAE(SI=1.73) 0.3730±0.0093AE(SI=1.36)組分Ⅵ 0.2585±0.0161bcFM(SI=1.00) 0.2654±0.0162cdCDM(SI=0.93) 0.2853±0.0052BM(SI=1.04)

2.2 EPTH及分級組分的蛋白質含量

酶解液及分級組分的蛋白質含量結果如表 2所示,隨著截留分子質量的降低,各分級組分的蛋白質含量降低;EPTH主要由 10KD以上(組分Ⅰ)和 10～5 kD(組分Ⅱ)的多肽組成,分別占 38.21%、38.9%,1 kD以下(組分Ⅴ)的小肽只占 5.39%。

表 2 EPTH及分級組分的蛋白質含量Table 2 Contentof protein of EPTH and its portions

3 結果與討論

脾臟是周圍淋巴器官,內有大量的 T、B淋巴細胞,是產生細胞和體液免疫應答的部位,有絲分裂原ConA和 LPS能分別激活 T、B細胞,促進 T、B細胞增殖,機體淋巴細胞在受到非特異性抗原刺激后,細胞增殖分化,發(fā)生免疫應答反應。淋巴細胞增殖能力的強弱可反映機體細胞免疫功能的強弱.我們的結果顯示,組分Ⅱ(10～5 kD)和組分Ⅴ(1 kD以下)均是促進小鼠脾淋巴細胞增殖作用最顯著的組分,不僅本身具有有絲分裂原活性,單獨作用即能明顯促進淋巴細胞增殖,而且還能與有絲分裂 LPS、ConA協(xié)同促進淋巴細胞增殖,從而提高機體免疫力的能力,組分Ⅴ比組分Ⅱ顯示出更強的促進作用(P＜0.001);酶解液及其余 3組分對小鼠脾淋巴細胞的增殖均沒有顯著的促進或抑制作用。說明組分Ⅱ和組分Ⅴ富集了促進小鼠脾淋巴細胞增殖的因子。

膜分離方法用于蛋白及肽的分離在近年來取得了很大進展,Paule等[11]采用納濾膜處理 β-乳球蛋白的胰蛋白酶水解產物來除去其中的肽聚集體,使需要的肽得到富集,膜分離操作在免疫活性大豆肽研究開發(fā)過程中具有應用價值[12]。黃鰭金槍魚頭蛋白經酶解所得酶解液并沒有顯著的促進或抑制小鼠脾淋巴細胞增殖作用,經超濾分離所得的組分Ⅱ和組分Ⅴ單獨作用及與 LPS、ConA協(xié)同作用均能顯著促進淋巴細胞增殖,可能是酶解顯露了具有免疫促進作用的肽段,推測酶解液存在相互抗秸的因子,因而酶解液沒有顯示出促進或抑制小鼠脾淋巴細胞增殖作用,而超濾分離使組分Ⅱ和組分Ⅴ富集了促進小鼠脾淋巴細胞增殖的因子。本文結果為黃鰭金槍魚頭蛋白酶解液進一步開發(fā)利用研究提供了參考。

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