霞水母提取物抗凝血作用的初步研究

湯魯宏,鄧 超 ,林 丹 ,陳 偉

江南大學(xué)醫(yī)藥學(xué)院藥化與藥分研究室,無錫 214122

據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)調(diào)查發(fā)現(xiàn),心腦血管病是人類致命的頭號“殺手”。目前臨床上采用的抗血栓藥物如阿司匹林有明顯的胃腸道不良反應(yīng);抗凝血藥肝素,近年來發(fā)現(xiàn)不能抑制與纖維蛋白結(jié)合的凝血酶,這已成為血栓復(fù)發(fā)的關(guān)鍵因素,因此,研究安全有效、適于長期甚至終生服用的抗凝血、抗血栓藥物具有重要意義[1]。據(jù)報道,鯊魚軟骨中含有大量的黏多糖,具有抗凝血、溶血栓等生理功能;張新江從陶氏太陽海星(Solaster dawsoni Verril1)中分離制得的海星酸性黏多糖有緩和的抗凝血作用;包承鑫報道從刺參[Stichopus japonicus(Selenka)]體壁中提取的一種黏多糖,對彌漫性血管內(nèi)凝血(DIC)和血栓形成具有較強(qiáng)的抑制效果。

霞水母(Cyanea nozakii)俗稱麻蜇,屬于腔腸動物門(Coelenterata)缽水母綱(Cyphozoa)、霞水母屬(Cyanea),其傘狀體的直徑可達(dá) 1.5～2 m,是水母類群中最大的一種。關(guān)于以霞水母(Cyanea nozakii)為天然海洋生物資源,分離提取其生物體的各種成分并對其生物活性物質(zhì)進(jìn)行系統(tǒng)篩選和評價的研究,在國內(nèi)外尚未見任何報導(dǎo)。本實驗以霞水母這一災(zāi)害物種為原料,對從中提取的活性物質(zhì)進(jìn)行了抗凝血作用的研究。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

霞水母:采于南通呂四港,冷凍保存。霞水母提取物:參照相關(guān)文獻(xiàn)方法并進(jìn)行改進(jìn),霞水母通過酸溶酶解后進(jìn)行冷凍干燥得到的淡棕色粉末,使用前溶解在蒸餾水中(具體的制備方法參見已向國家申請的專利:200710171189.0)。已經(jīng)過急性毒性實驗證明該提取物無毒或毒性很小,最大安全劑量在15000 mg/kg以上。

1.2 實驗動物

健康雄性 ICR小白鼠,4 w,體重18～22 g,由揚(yáng)州大學(xué)比較醫(yī)學(xué)中心提供[批準(zhǔn)號:SCXK(蘇)2007-0001]。購回后飼養(yǎng) 3 d開始實驗以適應(yīng)環(huán)境。

1.3 實驗儀器和試劑

注射器(蘇州林華塑料制品有限公司);電子精密天平(酶特洛-托利多儀器(上海)有限公司);秒表計時器(上海手表五廠);TGL-16G臺式離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠);玻璃毛細(xì)管(華西醫(yī)科大學(xué)儀器廠)APTT、PT試劑盒(上海太陽生物技術(shù)有限公司)生理鹽水又本實驗室自制。

1.4 實驗方法

1.4.1 劑量設(shè)計及實驗動物分組

取 50只小白鼠隨機(jī)分為 5個組,每組 10只。其中 3組為霞水母提取物低、中、高劑量組,第 4組為空白對照組,第 5組為陽性對照組。霞水母提取物試驗組按人體日食推薦量 7 g/人(成人按每人 70 kg體重計)來設(shè)計動物實驗劑量,分別為 50、100、200mg/kg(相當(dāng)于人體日食推薦量的 0.5、1、2倍),空白對照組給予 0.5 mL/只生理鹽水,陽性對照組給予 0.5mL/只華法林,其劑量根據(jù)人體體表面積(成人按每人 70 kg體重計)是小鼠體表面積(20 g)的 387.9倍來計算,人體服用的預(yù)防劑量為 3mg/d,換算成小鼠的劑量為 0.4mg/kg。然后進(jìn)行下列各項抗凝血指標(biāo)的測定。

1.4.2 體內(nèi)出血時間測定

采用小鼠斷尾法。小鼠連續(xù)灌胃 7 d后,將小鼠固定,用利剪將小鼠尾尖 3 mm(提前標(biāo)記)處橫斷,待血液自行溢出開始計時。每隔 30 s用濾紙吸去血滴一次,直至血液自然停止,以濾紙吸時無血為結(jié)束時間,此時間為體內(nèi)出血時間[3]。

1.4.3 體內(nèi)凝血時間測定

采用毛細(xì)玻管法。小鼠連續(xù)灌胃 7 d后,用毛細(xì)玻管從小鼠眼睛內(nèi)眥取血,自血液進(jìn)入毛細(xì)管開始計時至充滿時離開,每隔 30 s從一端斷毛細(xì)管一次,當(dāng)毛細(xì)玻管內(nèi)血液出現(xiàn)絲狀物時計時結(jié)束,為凝血時間[3]。

1.4.4 體外凝血時間測定

取試驗樣品、生理鹽水(空白對照組)、華法林(陽性對照組)各 0.1m L,分置于 10支試管中,取正常小鼠拔眼球取血,將血液直接滴入刻度試管中至約 0.7mL,輕輕混勻并計時,每隔 5 s傾斜試管一次,觀察表層血液是否沿試管移動,至凝固時停止計時,為體外凝血時間[3]。

1.4.5 APTT(活化部分凝血活酶時間)、PT(凝血酶原時間)的測定

按照上述實驗動物分組方案,連續(xù)灌胃 3 d。末次給藥1 h后,從小鼠眼睛內(nèi)眥采血 1mL,置于含有1/10體積 0.109 mol/L枸櫞酸鈉抗凝液(1份抗凝液 +9份全血)的塑料離心管中,輕輕顛倒混勻,3000 rpm離心 15 min。收集上層液,-20℃凍存。然后按照試劑盒操作逐項進(jìn)行測定。

1.4.6 實驗數(shù)據(jù)處理

實驗數(shù)據(jù)用 SPSSv11.0進(jìn)行單因素方差分析統(tǒng)計處理。

2 結(jié)果與討論

2.1 體內(nèi)出血時間測定

試驗組小鼠的體內(nèi)出血時間均比空白對照組的延長,且低、中劑量組與空白對照組的差異具有高度顯著性 (P＜0.01),高劑量組與空白對照組的差異具有顯著性(P＜0.05)。表明霞水母提取物能延長小鼠的體內(nèi)出血時間,增強(qiáng)其抗凝血功能。試驗組各劑量組之間差異不顯著(P＞0.05)。試驗組小鼠的體內(nèi)出血時間均比陽性對照組縮短,結(jié)果見表 1。

表 1 霞水母提取物對小鼠體內(nèi)出血時間的影響(n=10,±s)Table 1 Effect of extract from Cyanea nozakii on the bleeding time in vivo ofm ice(n=10±s)

表 1 霞水母提取物對小鼠體內(nèi)出血時間的影響(n=10,±s)Table 1 Effect of extract from Cyanea nozakii on the bleeding time in vivo ofm ice(n=10±s)

注:與空白對照組比較*P＜0.05,**P＜0.01 Note:Compared with normal group*P＜0.05,**P＜0.01

組別Group劑量(mg/kg?d)Dosage時間(s)Time空白對照組Normal control 0 746.88±196.83低劑量組Low dosage 50 1395.14±211.71**中劑量組Middle dosage 100 1987.01±313.80**高劑量組High dosage 200 1265.73±265.00*陽性對照組Positive control 0.4 2112.25±102.13**

2.2 體內(nèi)凝血時間測定

試驗組的小鼠體內(nèi)凝血時間均比空白對照組的延長,且中劑量組與對照組的差異具有高度顯著性(P＜0.01),表明霞水母提取物能延長小鼠體內(nèi)凝血時間。其中低劑量組與中劑量的差異具有高度顯著性(P＜0.01),中劑量組與高劑量組具有顯著性差異(P＜0.05),與陽性對照組相比,小鼠的體內(nèi)凝血時間有所縮短,結(jié)果見表 2。

表 2 霞水母提取物對小鼠體內(nèi)凝血時間的影響(n=10±s)Table 2 Effectof extract from Cyanea nozakii on the blood clotting time in vivo ofm ice(n=10±s)

表 2 霞水母提取物對小鼠體內(nèi)凝血時間的影響(n=10±s)Table 2 Effectof extract from Cyanea nozakii on the blood clotting time in vivo ofm ice(n=10±s)

注:與空白對照組比較*P＜0.05,**P＜0.01 Note:Compared with normal group*P＜0.05,**P＜0.01

組別Group劑量(mg/kg?d)Dosage時間(s)Time空白對照組Normal control 0 345.53±103.59低劑量組Low dosage 50 383.36±144.13中劑量組Middle dosage 100 649.96±124.51**高劑量組High dosage 200 427.95±86.55*陽性對照組Positive control 0.4 729.31±36.29**

2.3 體外凝血時間測定

試驗組小鼠體外凝血時間均高于對照組,且中劑量組、高劑量組與對照組比較,差異有高度顯著性(P＜0.01),表明霞水母提取物能夠延長小鼠體外凝血時間。其中低劑量組與高劑量之間的差異具有高度顯著性(P＜0.01)。各試驗組的小鼠體外凝血時間均比陽性對照組縮短,結(jié)果見表 3。

表 3 霞水母提取物對小鼠體外凝血時間的影響(n=10±s)Table 3 Effectof extract from Cyanea nozakiion the blood clotting time in vitro ofmice(n=10,±s)

表 3 霞水母提取物對小鼠體外凝血時間的影響(n=10±s)Table 3 Effectof extract from Cyanea nozakiion the blood clotting time in vitro ofmice(n=10,±s)

注:與空白對照組比較**P＜0.01 Note:Compared with normal group**P＜0.01

組別Group劑量(mg/kg?d)Dosage時間(s)Time空白對照組Normal control 0 22.94±6.50低劑量組Low dosage 50 39.02±9.79中劑量組Middle dosage 100 71.60±2.84**高劑量組High dosage 200 143.30±25.78**陽性對照組Positive control 0.4 156±26.30**

2.4 APTT、PT測定

試驗組中各劑量組的 APTT、PT值均比空白對照組延長(P＜0.05),說明霞水母提取物能夠抑制內(nèi)源性途徑和外源性途徑凝血酶的產(chǎn)生,且對其內(nèi)源性途徑的抑制作用大于外源性途徑。其中,低劑量組與中劑量組的 APTT比較有顯著性差異(P＜0.05),各劑量組的 PT值之間無顯著性差異(P＞0.05)。陽性對照組主要是通過抑制外源性途徑凝血酶的產(chǎn)生,結(jié)果見表 4。

表 4 霞水母提取物對小鼠APTT、PT值的影響(n=10,±s)Table 4 Effectof extract from Cyanea nozakii on the APTT、PT ofm ice(n=10±s)

表 4 霞水母提取物對小鼠APTT、PT值的影響(n=10,±s)Table 4 Effectof extract from Cyanea nozakii on the APTT、PT ofm ice(n=10±s)

注:與空白對照組比較 *P＜0.05,**P＜0.01 Note:Compared with normal group*P＜0.05,**P＜0.01

組別Group劑量(mg/kg?d)Dosage活化部分凝血活酶時間(s)APTT延長Prolong凝血酶原時間(s)PT延長Prolong空白對照組 Normal control 0 28.79±4.12 - 11.83±1.52 -低劑量組 Low dosage 50 50.25±10.93** 74.53% 17.66±4.12* 49.27%中劑量組Middle dosage 100 59.73±6.43** 107.46% 21.86±3.41** 84.78%高劑量組 High dosage 200 53.15±6.43** 84.62% 20.03±1.82** 69.37%陽性對照組 Positive control 0.4 48.23±4.38** 67.52% 23.12±0.92** 95.44%

3 結(jié)論

本實驗首先測定了霞水母提取物對小鼠體內(nèi)出血時間、體內(nèi)凝血時間及體外凝血時間的影響,研究結(jié)果顯示該提取物能夠顯著延長小鼠體內(nèi)出血時間、體內(nèi)凝血時間及體外凝血時間,因此初步認(rèn)為霞水母提取物具有抗凝血作用。

APTT和 PT是臨床凝血功能檢測中最常用的 2個參數(shù)。其中 APTT主要用于檢測機(jī)體的內(nèi)源性凝血系統(tǒng),其延長或縮短分別反映凝血因子Ⅱ、V、Ⅷ、Ⅹ、Ⅺ和Ⅻ的血漿水平降低或增加。PT則檢測機(jī)體的外源性凝血系統(tǒng),其延長或縮短分別反映凝血因子Ⅰ、Ⅱ、Ⅴ、Ⅶ和Ⅹ的血漿水平降低或增加。本研究表明,霞水母提取物對小鼠 APTT和 PT均有顯著影響,提示該提取物的凝血機(jī)理可能是通過內(nèi)源性凝血途徑和外源性凝血途徑共同起作用的。

綜上可知,霞水母提取物中含有具抗凝血活性的有效成分,但其化學(xué)本質(zhì)及其發(fā)揮抗凝血作用的詳細(xì)機(jī)制還需進(jìn)一步探討。

1 WeiYX(魏玉西),Li J(李敬),Zhao AY(趙愛云),et al.The progress of investigate the anticoagulated blood of active compound from marine life.Chin JMarine Drugs(中國海洋藥物雜志),2006,25:47-50.

2 Lin XY(藺新英),Guo DM(郭冬梅),Su WN(蘇維娜).Study on the anti-coagulation effectofextract from black curd beans.Chin J Gerontology(中國老年學(xué)雜志),2006,26:1081-1082.