發(fā)酵芝麻餅粕中木脂素提取條件的優(yōu)化及特征物質的鑒別

邵元龍,董 英

江蘇大學食品與生物工程學院,江蘇鎮(zhèn)江 212013

芝麻作為一種貴重的油料作物,木脂素類化合物是其特征成分,在芝麻中含量為 0.5% ～1.0%[1]。酚類木脂素是重要的組成部分,含量約0.3%～0.5%,主要有為:芝麻素、芝麻素酚、芝麻林素、芝麻林素酚、芝麻酚。最新的研究表明,在制油過程中產(chǎn)生的副產(chǎn)品芝麻餅粕中仍然含有一定量的芝麻木脂素類化合物[2],近年來,有關芝麻木脂素的分離純化、流向、以及生理功能研究取得了較大的進展[3],如對芝麻素[4,5]、芝麻酚[6]、芝麻素酚[7]等的研究。

應用現(xiàn)代生物技術方法尋找新抗氧化劑的途徑前景廣闊,2007年,董英[8]用醬油曲霉發(fā)酵芝麻餅粕,發(fā)現(xiàn)可以提高其抗氧化活性,而對發(fā)酵后木脂素的提取條件和發(fā)酵組分變化并未深入探討。為此,本文仍選用該菌株對芝麻餅粕進行發(fā)酵,以抗氧化活性為指標,對提取條件再優(yōu)化。并對發(fā)酵后產(chǎn)生的新物質進行了分離和鑒別,為進一步開發(fā)利用芝麻餅粕奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 試驗材料與儀器

菌株:醬油曲霉(Aspergillus sojae),CICC 2128:購自中國工業(yè)微生物菌種保藏中心;芝麻餅粕由江蘇鎮(zhèn)江京友調(diào)味品公司提供;二苯代苦味肼基自由基(2,2-diphenyl-2-picrylhydrazyl,DPPH):購自美國Sigma公司。

JJ-1型電動攪拌器:江蘇金壇醫(yī)療儀器廠;LD5-10離心機:北京醫(yī)用離心機廠;YM50A電熱蒸汽壓力滅菌器:上海三申醫(yī)療器械有限公司;PSX智能型恒溫恒濕培養(yǎng)箱:寧波來福科技有限公司;WFJ-7200可見分光光度計:尤尼柯(上海)儀器有限公司;LC-20AT高效液相色譜:日本島津公司;CS9301(PC)薄層掃描儀器:日本島津公司。

1.2 發(fā)酵方法

醬油曲霉接種于土豆汁(PDA)斜面培養(yǎng)基上,28℃培養(yǎng) 72 h后,加入 10 mL無菌生理鹽水,用接種針刮下,調(diào)節(jié)菌液濃度為 0.86×108cfu/m L。取10 g烘干的脫脂芝麻餅粕加入 9m L蒸餾水,于 121℃滅菌 20min,冷卻后,接種 1mL制備好的種子懸液,搖勻,于 28℃條件下發(fā)酵 144 h。

1.3 提取工藝優(yōu)化方法

1.3.1 正交優(yōu)化試驗設計

在多次單因子對比試驗基礎上,選擇提取溶劑乙醇濃度(A)、提取時間(B)、總乙醇體積與芝麻餅粕質量比(液料比)(C)和提取次數(shù)(D)4個因素,考察 4因素對自由基清除率的影響,試驗因素水平見表 1。發(fā)酵結束后,按試驗設計方案加入提取液,于 50℃水浴攪拌提取,轉速 150 r/min。提取液于5000 r/m in離心 10 min。上清液經(jīng)濃縮或添加提取液,統(tǒng)一定容至 150 mL。對提取液的自由基清除率進行測定和分析。

表1 正交試驗設計因素水平表Table 1 Factors and levels in Orthogonal design

1.3.2 響應面優(yōu)化試驗設計

在探討了乙醇濃度、提取時間、液料比和提取次數(shù)對提取物抗氧化活性影響的基礎上,初步優(yōu)化出3個主要影響因素。根據(jù) Box-Behnken中心組合試驗設計原理,以提取時間、液料比、乙醇濃度為自變量,自由基清除率為響應值,對這 3個因素進一步優(yōu)化,設計了三因素三水平的響應面分析試驗,試驗的因素和水平取值見表 2。發(fā)酵條件和提取液處理條件與正交試驗一致。

表 2 響應面試驗因素水平表Table 2 Factors and levels in Response Surface design

1.4 DPPH自由基清除活性測定(Radical Scavenging Activity,RSA)

取定容的發(fā)酵提取液 1mL,用 50%的乙醇稀釋10倍,作為樣品液。DPPH溶液濃度為 7.5×10-6mol/mL,波長 517 nm,50%乙醇為對照。測定清除DPPH自由基的活性,測定方法參考[9]。

1.5 HPLC檢測木脂素提取液

發(fā)酵及未發(fā)酵提取液經(jīng) 0.45μm膜過濾,進樣量 10μL,LC-20AT,Shimadzu,Japan;柱徑:Shim-Pack VP-ODS,250 mm×4.6 mm,5 μm;流動相 ∶甲醇∶水 =70∶30(v/v);流速 ∶1.0 mL/m in;柱溫 30℃;檢測器及波長:SPD-20A,波長 287 nm為檢測波長,以芝麻素、芝麻林素標準品做外標。

1.6 特征物質分離純化及鑒別

1.6.1 特征物質的分離純化

采用硅膠柱層析分離,濕法裝柱,干法上樣,不同梯度的石油醚、石油醚/乙酸乙酯、乙酸乙酯洗脫。并用薄層色譜法檢測,將含有特征物質成分的洗脫液合并,適當濃縮后自然揮干溶劑析出晶體。

1.6.2 薄層色譜檢測(TLC)

將點樣的薄層玻板置于層析缸(環(huán)己烷∶乙醚∶乙酸乙酯 =20∶3∶3,v/v/v)中展開。自然晾干后進行薄層掃描。步長 0.04min、光斑大小 1.0×5.0 mm、起始 X:17.0 mm、起始 Y:22.0 mm、結束 Y:98.0 mm、列間距 18mm、檢測波長:287 nm、測光方式:反射、擺幅寬:1.0mm。

1.6.3 質譜技術(LC-MS)

Agilent 1100 LC-MSD,American;鞘氣流速 11 L/min;噴射壓:35 psig;溫度 350℃;毛細管電壓 4 kV;質量掃描范圍 m/z200～800;負離子源噴射。

2 結果和討論

2.1 芝麻餅粕木脂素提取條件的優(yōu)化

2.1.1 正交優(yōu)化試驗結果

從表 3可知,影響抗氧化物提取率因素的主次為 A＞C＞B＞D,即乙醇濃度對提取率影響最大,其次為液料比和提取時間,最弱的為提取次數(shù)。乙醇濃度為 60%時,提取物的平均自由基清除率為71.46%,濃度高于 80%時的平均清除率為69.02%,但無顯著的差異,提取次數(shù)之間差異微弱。從提取過程可操作性及經(jīng)濟學考慮,提取溶液體積和濃度,都應盡可能減小,且采用單次提取。

表 3 正交試驗設計L9(34)及結果Table 3 Design matrix and experimental results of Orthogonal

2.1.2 響應面優(yōu)化試驗結果

響應面試驗設計和結果見表 4,對所得數(shù)據(jù)采用 Desigh-Expert7.0 Trial軟件中的 RS(response surface)程序進行分析,應用 Model Graph程序作響應曲面圖和等高線圖。

經(jīng)回歸擬合,獲得 Aspergillus發(fā)酵芝麻餅粕提取物抗氧化活性對自變量提取時間、液料比和乙醇濃度的二次多項回歸方程為:RSA%=82.22+0.32A+1.88B+0.91C-0.21AB-0.78AC+0.45BC-4.71A2-4.066B2-3.16C2

表 4 響應面試驗設計和結果Table 4 Design matrix and experimental resu lts of Response Surface

模型方差分析見表 5,試驗所選用的二次多項模型具有高度的顯著性(P＜0.0001),失擬項不顯著(P=0.0753)。所以自由基清除率與預測值之間具有較好的擬合優(yōu)度,可用于 Aspergillus固體發(fā)酵提取物抗氧化活性的分析和預測。從 3個因素對提取物抗氧化活性的影響來看,回歸方程的一次項中B和 C對發(fā)酵提取物抗氧化活性的影響極顯著(P＜0.01),且影響能力 B＞C,即液料比 ＞乙醇濃度,提取時間的線性影響不顯著,各因素二次項 A2、B2和 C2的影響也達到了極顯著水平,交互作用項中僅AC達到了顯著(P＜0.05)的水平。這也表明了響應值的變化復雜,不僅受單因素的影響,而且還存在交互作用。

表 5 響應面試驗設計方差分析表Table 5 Analysis of variance for the response surface design

*P＜0.05,**P＜0.01

繼續(xù)對回歸方程進行數(shù)學分析,可得到最大響應值所對應的提取條件,擇優(yōu)的提取條件為:時間120.40min,液料比 15.70mL/g,乙醇濃度 61.30%,理論提取物抗氧化活性為 82.52%。各因素取值與中心點取值接近,且理論值與中心點試驗結果吻合,故無需做驗證試驗。而未發(fā)酵的對照提取物清除 DPPH自由基活性為 46.8%。

2.2 HPLC檢測木脂素提取液

由圖 1可知,經(jīng)過發(fā)酵的提取液 HPLC色譜圖中,在保持時間為 10.3 min時,發(fā)現(xiàn)一種含量有顯著提高的特征物質 Px。

圖1 芝麻餅粕木脂素提取物的 HPLC比較Fig.1 Comparison of sesame cake lignan extraction by HPLC

2.3 特征物質 Px分離純化及鑒別

2.3.1 TLC檢測結果

柱層析的特征物質 Px結晶經(jīng)過展開劑展層,紫外掃描的結果如圖 2所示,特征物質 Px峰型單一,無明顯的雜質峰,所以柱層析達到了提純的效果,獲得了單一的純化物。根據(jù)遷移的距離,計算出芝麻素的 Rf=0.425,特征物質 Px的 Rf=0.20。

2.3.2 質譜技術(LC-MS)

圖 2 紫外掃描芝麻素和特征物質PxFig.2 The UV scanning spectrum of sesamin and Px

對分離純化的特征物質進行 ESI/MS分析,質子化[M+H+]峰(m/z 370.0)產(chǎn)生的片段如圖 3所示,其分子量為 370 Da,失去一個 H后,變?yōu)?369.0 Da,分子量為:Mr=370.0 Da。根據(jù)相關文獻[10],確認產(chǎn)生的特征物質為芝麻素酚,分子組成為:C20H18O7,結構如圖 4所示。

3 結論

3.1 通過正交優(yōu)化試驗得出,影響從醬油曲霉發(fā)酵芝麻餅粕中提取抗氧化物質的各因素的主次順序為:A＞C＞B＞D,即乙醇濃度對提取率影響最大,其次為液料比和提取時間,最弱的為提取次數(shù)。

3.2 利用 Design expert設計軟件,采用響應面分析法優(yōu)化了從發(fā)酵的芝麻餅粕中提取木脂素的較優(yōu)條件為:時間 120.4min,液料比 15.70mL/g,乙醇濃度 61.3%,在此條件下,發(fā)酵提取物的抗氧化活性可達 82.52%,未發(fā)酵的對照為 46.8%。

3.3 HPLC檢測發(fā)酵的芝麻餅粕木脂素提取物中出現(xiàn)一種特征物質,利用硅膠柱層析技術分離純化、薄層色譜檢測和 LC-MS進行鑒別,確認該物質為芝麻素酚,分子量為:Mr=370.0 Da,分子組成為:C20H18O7。

通過對醬油曲霉發(fā)酵芝麻餅粕木脂素的提取和分析,發(fā)現(xiàn)一種含量顯著提高的木脂素,據(jù)文獻報道,其主要存在于芝麻油的加工和提煉過程中。該物質在體外和體內(nèi)均有較強的抗氧化能力,并且具有特殊的生理功效,對其產(chǎn)生機理和生理活性,有待于進一步研究。

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3 Feng ZY(馮志勇),Gu KR(谷克仁).Composition,structure and physiological function of lignans in sesame seed.China Oil(中國油脂),2004,29(7):56-60.

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