線粒體移動相關(guān)基因miro1在急性運動中的表達特征

劉慧君 翟克敏 趙斐 靳慶勛 喬海榮 劉洪濤 吉力立3， 張勇，

1軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院衛(wèi)生學(xué)環(huán)境醫(yī)學(xué)研究所（天津 300050） 2天津體育學(xué)院天津市運動生理與運動醫(yī)學(xué)重點實驗室（天津 300381） 3 Department of Kinesiology，University of Wisconsin-Madison，Madison，WI53706，US

線粒體作為真核細胞的“動力站”，在細胞中不斷地進行著移動、分裂與融合，線粒體移動分布的改變會影響諸如線粒體呼吸功能、線粒體在高能量需求位置定位、Ca2+穩(wěn)態(tài)等［1］，且線粒體移動的改變、線粒體定位異常與機體發(fā)育、多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病密切相關(guān)［2，3］。目前線粒體移動相關(guān)的分子生物學(xué)機制研究發(fā)現(xiàn)：多種哺乳動物細胞中Miro和Milton形成復(fù)合物與kinesin（馬達蛋白）連接，調(diào)控線粒體沿微管的移動［4，5］。Miro蛋白有 Miro1、Miro2兩種亞型，Miro1突變會抑制線粒體運輸，導(dǎo)致線粒體聚集成簇，并形成絲狀線粒體［6］。Masao Saotome等研究還發(fā)現(xiàn)不同Ca2+水平下，Miro對H9C2及原代腦皮層神經(jīng)細胞線粒體融合分裂具有雙向調(diào)節(jié)作用［7］?？梢?，Miro對維持線粒體正常的形態(tài)具有重要意義，并且可能通過線粒體形態(tài)分布的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)變化調(diào)整細胞內(nèi)不同區(qū)域的能量分配以及促進胞內(nèi)Ca2+信息傳遞。

目前對骨骼肌這一能量代謝很旺盛的細胞線粒體移動分布的研究鮮見報道，且線粒體移動是否參與了運動能量代謝的應(yīng)答尚不清楚。本實驗以急性運動為模型，研究骨骼肌在運動能量需求變化中，線粒體移動基因表達的動態(tài)變化，并初步探討線粒體能量代謝、H2O2生成與線粒體移動基因動態(tài)表達之間的可能關(guān)系及其生理意義。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組

雄性 C57 BL/6小鼠 40只（19～21g），7～8周齡，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司（SPF級），于正式實驗前一周購入，在本實驗室分籠飼養(yǎng)，自由飲食，飼料為標(biāo)準(zhǔn)嚙齒類飼料。飼養(yǎng)環(huán)境為21～24℃，相對濕度45%～55%，每日光照12h。將小鼠隨機分為5組，組間體重?zé)o顯著性差異。其中1組為安靜對照組（R，n=8），4組為急性運動組，分別以各時間點代表不同組：運動30min組（E30，n=8）、運動 60min組（E60，n=8）、運動 90min組E90，n=8）、運動 120min 組（E120，n=8）。

1.2 急性運動模型

以跑臺運動作為運動應(yīng)激模型。實驗前所有動物均未進行過跑臺運動。正式實驗前，動物先在跑臺上進行5min跑步以適應(yīng)跑臺環(huán)境（0°，5m/min）。運動組正式實驗采用中等強度運動（0°，13m/min）。

1.3 骨骼肌樣品制備及線粒體的提取

安靜對照組動物于安靜狀態(tài)、其它組于運動中不同時間點（E30、E60、E90、E120）即刻頸椎脫臼處死，迅速取出下肢骨骼肌，部分樣本液氮速凍，－80℃凍存?zhèn)溆眠M行基因測定；另外部分骨骼肌樣本立即進行H2O2測定及差速離心法提取線粒體。以上操作均在冰浴中進行。

1.4 線粒體生物力能學(xué)指標(biāo)檢測

用 Oxytherm液相氧電極（Hansatech，UK）測定密閉反應(yīng)體系中氧濃度的變化，以確定線粒體耗氧速率。測定以蘋果酸和丙酮酸為底物的態(tài)3、態(tài)4呼吸速率（單位為nmol/min·mg pro），呼吸控制比（respiration control rate，RCR），RCR是態(tài)3呼吸速率與態(tài)4呼吸速率的比值，此數(shù)值反映線粒體的呼吸功能。

1.5 骨骼肌H2O2的測定

根據(jù)H2O2與鉬酸銨作用生成穩(wěn)定的黃色過氧鉬酸絡(luò)合物的原理，用可見－紫外分光光度計（Beckman Co，USA），波長405nm測定其絡(luò)合物生成量可計算H2O2的濃度。剪碎組織，去除筋膜、脂肪；加入生理鹽水，用玻璃勻漿器勻漿；2500r/min 4℃離心 10min，取上清，嚴(yán)格按照南京建成生物工程研究所試劑盒說明書進行檢測。

1.6 ATP合成酶活性測定

采用熒光素－熒光素酶發(fā)光法［8］，用 20/20n型發(fā)光儀（TurnerBiosystem Co，USA）測定ATP合成酶活性。反應(yīng)溫度為25℃，在0.5ml反應(yīng)體系中含有EDTA 0.5mM，HEPES 10mM，磷酸鉀緩沖液5mM，MgCl22.5mM，熒光素－熒光素酶 100μl，0.5M 蘋果酸 /0.25M 谷氨酸，50μg線粒體。記錄以上體系中發(fā)光強度為本底，加入4μM ADP后啟動線粒體ATP合成反應(yīng)，記錄發(fā)光強度。在不加線粒體及ADP的平行實驗中，加1nM ATP，記錄發(fā)光強度作為ATP合成量的標(biāo)定（酶活力單位：nmol/min·mg pro）。

1.7 骨骼肌miro1 mRNA熒光定量PCR分析

使用 Trizol（Invitrogen）提取骨骼肌總 RNA，通過0.8%的瓊脂糖電泳和紫外分光光度計確定總RNA完整性和純度；嚴(yán)格按照RevertAid First Strand cDNA Syn thesis Kit（Fermentas）說明書進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。采用Applied Biosystems StepOneTMReal-Time PCR System（BIORAD，USA）進行熒光定量PCR反應(yīng)，引物由寶生物工程（大連）有限公司合成。miro1上游引物5’-CTGATTATGTCGCTGGTCAGTGAAG-3’，下游引物 5’-GGTGACGTCAGCTGGAATGG-3’，產(chǎn)物 84bp；18S rRNA 上游引物5’-GGGAGCCTGAGAAACGGC-3’，下游引物 5’-GGGTCGGGAGTGGGTAATTT-3’，產(chǎn)物68bp。熒光定量 PCR條件：預(yù)變性 95℃/30s，95℃/5s，60℃/30s，共 40個循環(huán)。根據(jù) SYBR～Premix Ex Taq Kit（BIO-RAD）說明書配制反應(yīng)體系，目的基因的相對變化量（Fold Change）＝2－Δ（ΔCT），ΔCT=CTtarget-CT18s，Δ（ΔCT）=ΔCTstimulated-ΔCTcontrol。

1.8 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 miro1 mRNA含量的變化

如圖1所示，120分鐘運動過程中miro1 mRNA表達均較安靜組顯著升高，E30、E60、E90、E120 組分別較安靜組升高32.8%、107.6%、63.8%及44.8%，E60組達峰值。

2.2 線粒體ATP合成酶活性及呼吸速率變化

如表1所示，E30組ATP合成酶活性較安靜組明顯升高，其余各組均無明顯變化。整個運動過程中線粒體RCR無顯著變化。

表1 急性運動中骨骼肌線粒體力能學(xué)分析

2.3 骨骼肌H2O2濃度變化

如圖2所示，120分鐘運動過程中骨骼肌H2O2均較安靜組顯著升高，其中E30、E60和E90組H2O2持續(xù)升高，分別較安靜組升高了 22.1%、26.7%、37.6%，E90組達峰值。

3 討論

近些年，越來越多的研究證據(jù)表明線粒體形態(tài)分布的動態(tài)改變與能量代謝、細胞生理病理密切相關(guān)。線粒體與細胞骨架的相互作用會影響能量代謝及線粒體在高能量需求位置定位、Ca2+穩(wěn)態(tài)、線粒體呼吸功能、融合分裂等［2］。如：牛晶狀體表皮及上皮細胞線粒體移動發(fā)生改變的同時線粒體內(nèi)膜電位也發(fā)生變化，揭示線粒體通過移動使能量從線粒體網(wǎng)絡(luò)的低能量區(qū)域傳播到高能量需求區(qū)域［9］；心成肌細胞及原代腦皮層神經(jīng)細胞胞漿中游離鈣離子濃度（［Ca2+］i）水平不同時，線粒體移動可調(diào)控線粒體融合分裂的動態(tài)變化［7］。這些實驗結(jié)果提示：線粒體移動參與細胞內(nèi)信息傳遞、能量交換。線粒體移動的分子機制研究表明：線粒體移動相關(guān)蛋白Miro屬于小GTPase家族，位于線粒體外膜，含兩個Ca2+結(jié)合的EF手型結(jié)構(gòu)域［4］。H9C2 及原代腦皮層神經(jīng)細胞中，［Ca2+］i靜息水平時，過表達Miro增強線粒體移動并促進線粒體趨于融合；［Ca2+］i升高或鈣振蕩時，過表達Miro促進線粒體趨于分裂［7］。COS-7及HEK293T細胞中Miro1突變導(dǎo)致線粒體聚集成簇，形成絲狀線粒體，影響線粒體移動及分布［6］。果蠅缺失dmiro會影響線粒體沿微管移動，導(dǎo)致部分神經(jīng)傳遞功能缺失［10］。截至目前，運動應(yīng)激過程中，骨骼肌這一能量代謝很旺盛的組織與線粒體移動分布的研究尚未見報道。本研究發(fā)現(xiàn)：一次中等強度負荷急性運動過程中，C57小鼠骨骼肌miro1 mRNA表達均較安靜組顯著升高，其中E60組較安靜組升高了107.6%。這說明急性運動過程中，線粒體移動相關(guān)基因miro1表達迅速增加，線粒體可能通過移動、動態(tài)分布的改變適應(yīng)細胞能量需求的急劇變化。

此外，本研究結(jié)果表明：急性運動中E30組ATP合成酶活性較安靜組顯著增加，其余各組無明顯變化；整個運動過程中線粒體呼吸控制比較安靜組升高，但無顯著性變化。這說明急性運動初期線粒體ATP合成速率加快，在急性運動時間延續(xù)過程中線粒體能量代謝水平尚可滿足能量需求的變化。以上結(jié)果提示：急性運動中，因線粒體移動相關(guān)基因miro1表達增加而活躍的骨骼肌線粒體移動，可能利于促進線粒體呼吸和ATP合成，以應(yīng)對組織能量需求的變化。

是什么因素誘導(dǎo)線粒體移動基因表達迅速增高，擬或也對能量需求變化產(chǎn)生快速應(yīng)答？盡管目前對線粒體移動調(diào)控機制的認識尚不清晰，但相關(guān)研究表明：多種細胞中局部Ca2+、NO濃度變化均可調(diào)控線粒體移動動態(tài)改變［11，12］。本研究結(jié)果表明：急性運動中骨骼肌 H2O2均較安靜組顯著升高，其中E30、E60和E90組H2O2持續(xù)升高，E90組達峰值，E120組比E90組略有降低但仍明顯高于安靜組。已知線粒體呼吸鏈產(chǎn)生的超氧陰離子（O2-·）、H2O2等自由基是細胞中ROS的95%來源，它們對調(diào)節(jié)細胞氧化還原狀態(tài)、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和細胞凋亡調(diào)控等都有重要作用。研究表明，細胞內(nèi)ROS信號系統(tǒng)與鈣信號系統(tǒng)之間具有密切的相互作用［13，14］。根據(jù)已有研究及本文現(xiàn)有結(jié)果提示：一次急性運動導(dǎo)致骨骼肌細胞對能量需求急劇增加的同時伴隨H2O2生成急劇增多，H2O2可能作為信號分子調(diào)控Ca2+，Ca2+與線粒體移動相關(guān)蛋白miro結(jié)合影響線粒體移動［7，15］，調(diào)節(jié)線粒體在工作細胞內(nèi)的重新分布，從而有助于線粒體與胞漿和其它細胞器之間的物質(zhì)、信息和能量交換。

目前，對線粒體移動的研究尚不夠深入，還未見骨骼肌細胞線粒體移動的報道，以至于我們對其具體的調(diào)控機制和生理意義知之甚少。本文在急性運動中發(fā)現(xiàn)的骨骼肌線粒體移動相關(guān)基因的表達特征，是否作為一個與運動能量代謝相關(guān)的“早期細胞事件”參與了線粒體的能量轉(zhuǎn)換調(diào)節(jié)，這一事件與ROS和Ca2+等信號分子作用的關(guān)系及其是否通過調(diào)節(jié)線粒體融合與分裂影響線粒體動態(tài)重構(gòu)等值得待進一步深入研究。

4 總結(jié)

C57 BL/6小鼠一次中等強度負荷跑臺運動中，與安靜對照組相比miro1 mRNA表達顯著增加，骨骼肌H2O2顯著增高，E30組ATP合成酶活性明顯增加，線粒體呼吸控制比無顯著變化。提示急性運動中骨骼肌線粒體移動相關(guān)基因miro表達增加，可能利于促進線粒體呼吸和ATP合成，以應(yīng)對工作細胞能量需求的變化。

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