不同運(yùn)動(dòng)時(shí)間對(duì)2型糖尿病大鼠骨骼肌IRS-2蛋白含量及磷酸化的影響

華宏 王耀光 郭仁勇

1遼寧師范大學(xué)體育學(xué)院（大連 116029） 2遼寧師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院

胰島素受體底物-2（insulin receptorsubstrate，IRS-2）是細(xì)胞質(zhì)中的接頭蛋白（Adaptor），主要連接胰島素受體（IR）和多種效應(yīng)分子，從而介導(dǎo)細(xì)胞對(duì)胰島素（INS）等的反應(yīng)［1］。隨著基因剔除技術(shù)的發(fā)展，發(fā)現(xiàn)剔除IRS-2基因的純合子動(dòng)物（IRS-2-/-）具有 2型糖尿?。―M）的全部特征［2］，因此IRS-2及活動(dòng)規(guī)律成為近來2型DM研究的熱點(diǎn)。運(yùn)動(dòng)是治療2型糖尿病的主要非藥物手段，運(yùn)動(dòng)可提高胰島素的敏感性和作用效果，由于IRS-2的特殊作用，運(yùn)動(dòng)對(duì)胰島素的影響與IRS-2的介導(dǎo)功能相關(guān)。有研究發(fā)現(xiàn)運(yùn)動(dòng)可提高IRS-2蛋白表達(dá)和磷酸化程度［3，4］，但不同運(yùn)動(dòng)時(shí)間對(duì) IRS-2含量和磷酸化的影響還不清楚。故本實(shí)驗(yàn)通過測(cè)定2型糖尿病大鼠進(jìn)行8周不同運(yùn)動(dòng)時(shí)間的跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)后骨骼肌IRS-2蛋白含量及磷酸化變化，為DM運(yùn)動(dòng)療法提供更科學(xué)的理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物

70只健康 Sprague-Dawley（SD）大鼠，體重（200±16）g，雌雄不拘，由大連醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心提供（許可證號(hào)：SCXK（遼）2004-0017）。在標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境下常規(guī)分籠喂養(yǎng)，自由飲水進(jìn)食。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后進(jìn)行適應(yīng)性訓(xùn)練。隨機(jī)選擇10只大鼠為正常對(duì)照組，其余為實(shí)驗(yàn)組，制備2型糖尿病大鼠模型。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 2型糖尿病大鼠模型制備

參照洪麗莉等的方法制備模型［5］。實(shí)驗(yàn)組大鼠進(jìn)行4周高脂飼料喂養(yǎng)，同時(shí)加3%果糖飲水。4周后按30mg/kg體重的劑量一次性腹腔內(nèi)注射STZ（溶于0.1 mmol/L檸檬酸緩沖液，pH4.4）。注射后1周進(jìn)行葡萄糖耐量試驗(yàn)。方法為：大鼠禁食4～6小時(shí)，經(jīng)腹腔注射葡萄糖（2g/kg體重），斷尾采血測(cè)定0、60和120min時(shí)的血糖。DM診斷標(biāo)準(zhǔn)為連續(xù)2次空腹血糖（FGB）≥7.8mmol/L或葡萄糖負(fù)荷后2h血糖≥11.1mmol/L［6］。此方法造模成功率達(dá)85%。2周后，大鼠禁食12h后，斷尾取血，用羅氏試紙測(cè)大鼠空腹血糖（FBG），同時(shí)檢測(cè)空腹胰島素（FINS）。

高熱量飼料配方：100kg大鼠基礎(chǔ)飼料中加人全蛋粉6kg（大連生化制品有限公司生產(chǎn)）、蔗糖23kg（廣西糖業(yè)集團(tuán)銷售有限公司生產(chǎn)）、煉豬油26.5kg（河北石家莊制造），混和成形，烤干成150kg。其總熱量為20.083J/g，即4.80CaUg，其中蛋白質(zhì)占15%，碳水化合物占51%，脂肪占25%。

1.2.2 糖尿病大鼠運(yùn)動(dòng)方案

將符合標(biāo)準(zhǔn)的50只糖尿病大鼠隨機(jī)分為糖尿病對(duì)照組和糖尿病運(yùn)動(dòng)組（20min組、40min組、60min組和80min組），并繼續(xù)高脂飼料喂養(yǎng)。各糖尿病運(yùn)動(dòng)組運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度參照 Soya等的實(shí)驗(yàn)［7］，以20m/min進(jìn)行8周跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)。運(yùn)動(dòng)時(shí)間分別為每天20min、40min、60min和80min。對(duì)照組常規(guī)飼養(yǎng)。本實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的處置符合國(guó)際實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理學(xué)要求。

1.2.3 取材和指標(biāo)測(cè)定

各組大鼠運(yùn)動(dòng)后即刻腹腔內(nèi)注射3%戊巴比妥鈉50mg/kg體重）麻醉，取后肢股四頭肌肉組織，置于液氮中，待提取蛋白質(zhì)。

稱取骨骼肌100mg，剪碎后置于組織勻漿液600μl 2%SDS，50mmol/L Tris-HCl，pH6.8，10%甘油，1mmol/L Na3VO4，1mmol/L PMSF，5g/L Leupeptin）中，采用 Poly ron PT10-35組織擴(kuò)散儀制備組織勻漿（7000～10000g）。所得勻漿置于4℃、10000g離心10min，取上清液，采用改良Lowery法測(cè)定蛋白濃度［8］，以備上樣。

1.2.4 IRS-2蛋白表達(dá)測(cè)定

采用Western blot免疫印跡法。取含等量總蛋白50μg）的樣品，經(jīng)7.5%SDS-PAGE分離，電轉(zhuǎn)膜后以 5%脫脂奶粉封閉，再分別與兔抗人IRS-1和IRS-2多克隆抗體反應(yīng)，繼而與辣根過氧化酶標(biāo)記的羊抗兔二抗作用，以增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法（ECL）顯示蛋白條帶，并用激光光密度掃描儀測(cè)定蛋白條帶光密度。

1.2.5 IRS-2蛋白磷酸化的測(cè)定

采用免疫沉淀及增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法。取含等量總蛋白500μg）的樣品，與抗IRS-2抗體4℃孵育過夜?？乖贵w復(fù)合物經(jīng)固相化蛋白G沉淀后，重新溶解于Laemmli上樣緩沖液，加熱到95℃ 5min，經(jīng)7.5%聚丙烯酰氨凝膠電泳1.5h。抗－磷酸化酪氨酸免疫印跡，醋酸纖維薄膜直接與辣根過氧化物酶結(jié)合的一抗APY20H孵育1.5h。充分洗滌后與ECL反應(yīng)1min，即刻X線片曝光，洗片后用Leica Q550-IW圖像分析儀（德國(guó)）進(jìn)行掃描，計(jì)算光密度。

以正常對(duì)照組的IRS-2蛋白含量和磷酸化為100作為標(biāo)準(zhǔn)，計(jì)算其他各組的相對(duì)量。

1.2.6 試劑與儀器

IRS-2多克隆抗體夠自R&D Systems公司，ECL購自英國(guó)Amersham公司。預(yù)染蛋白Marker購自New England BioLabs。血糖（FBG）用快速血糖儀檢測(cè)，儀器及試紙由美國(guó)強(qiáng)生公司生產(chǎn)。胰島素（FINS）用放射免疫法檢測(cè)，試劑盒由南京生物工程研究所提供，批內(nèi)CV<3%，批間CV<5%。甘油三酯（TG）試劑盒：北京福瑞生物工程公司生產(chǎn)，批號(hào)：040702?？偰懝檀迹═c）試劑盒：北京福瑞生物工程公司生產(chǎn)，批號(hào)：040702。動(dòng)物跑臺(tái)由北京碩林苑科技有限公司生產(chǎn)，型號(hào)為SLY-RTML六跑道大鼠跑臺(tái)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS11.0軟件包對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間顯著性差異比較采用單因素方差分析（ONE-WAY ANOVA），多重比較采用LSD法。顯著性水平α為0.05。

2 結(jié)果

表1顯示，與正常對(duì)照組相比，糖尿病大鼠體重明顯增加（P<0.01），血清甘油三酯和總膽固醇水平也明顯升高（P<0.01），同時(shí)血糖和胰島素水平明顯升高P<0.01）。

表1 造模成功后兩組大鼠體重、血糖、血脂和胰島素水平

表2顯示，與對(duì)照組相比，糖尿病對(duì)照組股四頭肌IRS-2蛋白含量下降41%（P<0.01）。與糖尿病對(duì)照組相比，運(yùn)動(dòng)20min組、40mmin組、60min組和80min組分別升高 11.7%、12.4%、12.2%和 11.9%（P<0.01）。與 20min組及80min組相比，40min組IRS-2蛋白含量分別升高10.9%和10.7%（P<0.05）。但各組仍未恢復(fù)到正常對(duì)照組水平。

與對(duì)照組相比，糖尿病對(duì)照組股四頭肌 IRS-2磷酸化水平下降49%（P<0.01）。與糖尿病對(duì)照組相比，運(yùn)動(dòng)20min組、40mmin組、60min組和 80min組分別升高 11.2%、12.7%、12.2%和 11%（P<0.05和 P<0.01）。與 20min組和80min組比，40min組和60min組分別升高11.3%、11.5%（P<0.01）和 10.9%、11.1%（P<0.05）。但各組仍沒有恢復(fù)到正常對(duì)照組水平。

表2 各組大鼠股四頭肌IRS-2蛋白含量及磷酸化比較

3 討論

根據(jù)Soya對(duì)運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度的確定依據(jù)，20m/min相當(dāng)于LT（乳酸閾）強(qiáng)度，LT為有氧代謝向無氧代謝的轉(zhuǎn)折點(diǎn)，相當(dāng)于4mmol/L血乳酸濃度，當(dāng)運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度高于LT時(shí)，機(jī)體的代謝開始轉(zhuǎn)向無氧代謝。LT已經(jīng)成為有氧健身鍛煉和康復(fù)訓(xùn)練的一個(gè)強(qiáng)度標(biāo)準(zhǔn)。美國(guó)運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)會(huì)（ACSM）和美國(guó)糖尿病協(xié)會(huì)（ADA）運(yùn)動(dòng)鍛煉方案：運(yùn)動(dòng)與糖尿病專業(yè)指南［9］也將LT強(qiáng)度列為糖尿病康復(fù)鍛煉推薦的上限強(qiáng)度。IRS-2主要連接胰島素受體（IR）和多種效應(yīng)分子［10］。INS與IR結(jié)合后，IR的 β 亞基近膜區(qū)酪氨酸（Tyr）自身磷酸化并且與IRS-2結(jié)合，IR上激活的酪氨酸蛋白激酶（PTK，IR-TK）催化 IRS-2上多個(gè) Tyr磷酸化，為下游含SH2區(qū)的蛋白提供位點(diǎn)，形成信號(hào)蛋白復(fù)合物，以介導(dǎo)進(jìn)一步的信號(hào)傳導(dǎo)［11，12］。Park等的研究發(fā)現(xiàn)，運(yùn)動(dòng)可提高IRS-2蛋白含量和磷酸化程度［13－15］，但這些實(shí)驗(yàn)均采用單一固定時(shí)間，不同運(yùn)動(dòng)時(shí)間對(duì)IRS-2蛋白含量和磷酸化影響的研究還未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，8周運(yùn)動(dòng)后，與糖尿病對(duì)照組相比，運(yùn)動(dòng)組大鼠骨骼肌IRS-2蛋白含量顯著增加，不同運(yùn)動(dòng)時(shí)間效果不同，并且IRS-2磷酸化的作用效果也存在差異，以運(yùn)動(dòng)40min效果最好。由于此類研究才剛開始，還需進(jìn)一步探索。

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