CKMB和cTnI在缺氧誘導(dǎo)in vitro心肌細胞中的表達

甄子朋 張杰

1臨沂師范學(xué)院體育學(xué)院（山東 臨沂 276005） 2四川大學(xué)華西醫(yī)院衛(wèi)生部移植工程與移植免疫重點實驗室

CKMB和cTnI（cardiactroponin I，cTnI）均可在心肌組織中表達，二者可從功能和結(jié)構(gòu)兩個方面反映心臟的健康程度。CKMB是肌酸激酶（CK）的同工酶之一，劇烈活動時負責(zé)催化磷酸肌酸與ATP之間進行高能磷酸鍵的轉(zhuǎn)換。在心肌細胞中，大多數(shù)cTnI結(jié)合于肌鈣蛋白－原肌球蛋白復(fù)合物中，正常情況下，由于心肌新陳代謝的需求，約有3～8%作為代謝底物存在于胞漿內(nèi)［1］。健康人血中不含或含極低量的cTnI。當(dāng)心肌因各種因素發(fā)生凋亡或變性壞死時，細胞膜破損，CKMB、cTnI可彌散進入細胞間質(zhì)，較早地出現(xiàn)在外周血中。目前cTnI已作為臨床上判斷心肌損傷的常規(guī)指標(biāo)來使用［2，3］。

大量臨床觀察及研究均證實運動可以誘發(fā)心肌損傷，引起血液中CKMB及cTnI濃度升高［4］。不論臨床病人還是運動員，造成心肌損傷的具體機制至今不明。Rowe［5］認為造成運動性心肌損傷的原因由兩個生理性惡性循環(huán)”引起，一個是嚴重缺血和高兒茶酚胺，另外一個是冠狀動脈痙攣和內(nèi)皮損傷，它們共同作用可以引起心肌缺氧，后者可導(dǎo)致心肌損傷。另外，也有研究認為去甲腎上腺素可引起心肌損傷［6］。但均缺乏確切的證據(jù)。研究已證實在機體所有組織中，大部分組織氧供充足，但心肌組織即使是在正常情況下其氧含量也處于低飽和狀態(tài)［7］。因此研究缺氧在心肌損傷中的地位和作用十分必要。

本研究采用RT-PCR和Western Blotting方法，觀察給予單純?nèi)毖醮碳ず蠼】荡笫骾n vitro心肌細胞CKMB和cTnI表達變化，探討表達機制，為理解缺氧誘發(fā)cTnI和CKMB表達與心臟健康之間的關(guān)系提供參考。

1 材料和方法

1.1 細胞培養(yǎng)

1.1.1 心肌細胞的培養(yǎng)

取新生Wister大鼠（四川大學(xué)華西臨床醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供），在其心臟跳動時將心臟取下。小心剪取左心室組織，用冰PBS液（pH7.4）清洗干凈后，將組織反復(fù)剪成0.5～1mm3的小塊，加2～3滴細胞培養(yǎng)液，用吸管輕輕吹打后分次吸取組織塊懸液，將其均勻排在75ml培養(yǎng)瓶（Falcon）底壁上，后加入含 150ml/L小牛血清、0.1mM 5-溴脫氧核苷 （5-Bromodeoxyuridine；Brdu）的DMEM培養(yǎng)液3ml，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱（Sanyo）中孵育30～40min后，待組織塊略干能貼于瓶壁上，再緩慢、輕輕地將培養(yǎng)瓶翻轉(zhuǎn)，使培養(yǎng)液浸泡組織塊，繼續(xù)靜止培養(yǎng)。每天小心置于相差顯微鏡（Nikon）下觀察，約3～4天后待細胞多數(shù)連接成片，加入0.1%胰蛋白酶（Invitrogen）1ml，放倒置顯微鏡（Nikon）下觀察，等部分細胞呈圓形，棄胰蛋白酶液，加入含有0.1mM Brdu培養(yǎng)液5～10ml反復(fù)小心吹打，后1000r/min離心收集細胞，將濃度調(diào)至5×106·ml-1。

取1.5ml細胞同3ml DMEM培養(yǎng)液混合后，置于75ml培養(yǎng)瓶中繼續(xù)傳代培養(yǎng)，2～3天定量換培養(yǎng)液一次。供后面實驗使用。

1.1.2 缺氧刺激

將細胞分成缺氧刺激組（H組）和對照組（C組）。換培養(yǎng)基后的第2天，H組進行如下操作：旋緊培養(yǎng)瓶蓋，并使用無菌封口膠將瓶蓋周圍封閉，然后在孵箱中標(biāo)準條件下缺氧孵育40分鐘，后恢復(fù)正常條件繼續(xù)培養(yǎng)。分別 于 缺 氧 刺 激 完 成 后 即 刻 、15min、30min、45min、1h、24h、48h后分別收集上清液（supernatant，SP）和細胞。將細胞用PBS稀釋后，血細胞計數(shù)板計數(shù)將濃度調(diào)至5×107·ml-1，取 50μl臺盼藍染色，確定細胞的活性；其余細胞（2ml）封口膠封閉后4℃儲存，備后續(xù)實驗用。將上清液置于－70℃冰箱（Heraus）中備用。

1.2 生化指標(biāo)的檢測

1.2.1 RT-PCR二步法檢測HIF-1α因子的表達

將所有收集的細胞用PBS洗一次，離心濃縮后置于DEPC處理過的EP管中，加入1ml Trizol試劑（Takara），洗頭小心吹打數(shù)次后加入氯仿0.2ml（0.2ml/1mlTrizol），用力振搖 10～20s，置室溫下 2～3min；8000r/min，4℃離心15min，將上層水相轉(zhuǎn)移至新的1.5ml EP管中；加入0.5ml的異丙醇（0.5ml/1mlTrizol），室溫沉淀 10min，8000r/min離心10min；去上清，沉淀中加入 1ml 75%乙醇溶液（DEPC水稀釋），震蕩混勻后，7500r/min、4℃離心5min；去上清，室溫下空氣揮發(fā)殘存的乙醇液（約10min）；加入100μl DEPC處理的水溶解RNA，吸頭小心吹打溶解，后置－20℃保存；取10μl RNA做瓊脂糖電泳（5%，水平電泳儀，Bio-Rad）。另取 5μl RNA稀釋 20倍后在分光光度計（Bio-Rad）上測定RNA的濃度和純度。RNA 樣品的濃度 （ng/μl）：A260×稀釋倍數(shù)×40；RNA 樣品的純度：1.82.0時表明可能有異硫氰酸殘存或RNA降解）。

RT和PCR階段反應(yīng)體系的試劑配比按照試劑盒（Takara）說明書操作。內(nèi)參為GAPDH，各因子引物設(shè)計采用primer5.0軟件。HIF-1α引物序列為F：5’-TCAAAGTCGGACAGCCTCA-3’；R：5’-CCCTGCAGTAGGTTTCTCT-3’；GAPDH 引物序列為 F：5’-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3’；R：5’-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3’。反應(yīng)條件為：94℃變性 30s→53℃褪火 30s→72℃延伸 4min。上述循環(huán)次數(shù)：30次。瓊脂糖（2.0%）電泳鑒定表達情況。

1.2.2 細胞總蛋白的提取

將收獲的細胞以0.1M pH7.4的冷PBS洗滌3次，加入600μl RIPA裂解液，同時按照100∶1加入雞尾酒蛋白酶抑制劑（Calbiochem）和磷酸酶抑制劑（Invitrogen），4℃振蕩 30min后超聲 10s，以 13000r/min離心 30min后，用BCA蛋白檢測試劑盒（Pierce）測定提取蛋白濃度，存于－70℃冰箱（Heraus）中備用。

1.2.3 Western Blotting檢測CKMB和cTnI的表達

配制分離膠和積層膠（15%）。加等量加樣buffer，后將樣品100℃中煮沸5min。上樣進行SDS-PAGE電泳（垂直電泳儀，Bio-Rad）。開始電壓為80V，當(dāng)樣品跑出濃縮膠，進入分離膠后，將電壓調(diào)至120V。等電泳完成，將蛋白轉(zhuǎn)膜至PVDF膜（Millipore）上。后用5%脫脂奶粉于室溫封閉2h。后將一抗（羊抗，Pierce）用5%脫脂奶粉稀釋，把含有蛋白的PVDF膜置于其中，4℃震蕩孵育過夜。第2天，用 TBST（10mmol/L的 Tris堿、150mmol/L氯化鈉、0.1%Tween 20、pH 8.0）室溫搖洗 3×10～15 分鐘。后用HRP標(biāo)記的二抗（Pierce）繼續(xù)孵育 2h（室溫），TBST搖洗。后加Super Signal West Dura Extended Duration Substrate檢測免疫反應(yīng)性。最后在暗室內(nèi)進行自顯影（按照試劑盒說明）。使用掃描儀（聯(lián)想，LS5260U）掃描膠片、得圖，后使用Image Pro-Plus（3.0版本）進行IOD分析。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 HIF-1α表達變化

缺氧刺激后即刻，胞內(nèi)即有HIF-1α表達，在30min達峰值后逐漸下降，48h后消失。

2.2 CKMB的時相性變化

圖2顯示，缺氧刺激后，上清中和胞內(nèi)（intracellular，IC）均有CKMB表達。上清中CKMB升高趨勢較平緩，一直持續(xù)到實驗結(jié)束。缺氧后0min胞內(nèi)CKMB水平顯著升高（P<0.05），1h達峰值，后明顯下降。缺氧刺激后，胞內(nèi)與上清中CKMB濃度的顯著性差異從15min起一直持續(xù)到24h（P<0.05）。缺氧心肌細胞內(nèi)CKMB濃度一直顯著高于對照細胞內(nèi)濃度（P<0.05）。

2.3 cTnI的時相性變化

圖3顯示，缺氧刺激后15min，上清中cTnI濃度急劇升高，且隨時間延續(xù)其升高趨勢亦延續(xù)，24h后達峰值，48h后仍然高表達。胞內(nèi)則持續(xù)表達cTnI，隨時間延續(xù)逐漸升高，45min后達到峰值，后明顯下降。在實驗的48h內(nèi)，SP和IC呈近似同步性表達。缺氧心肌細胞內(nèi)與上清中cTnI濃度除0min時間點外，其余時間點均存在顯著性差異（P<0.05）。缺氧心肌胞內(nèi)cTnI濃度在所有檢測時間點均顯著高于對照心肌細胞內(nèi)濃度（P<0.05）。

3 討論

本實驗中，缺氧誘導(dǎo)培養(yǎng)的in vitro心肌細胞胞內(nèi)CKMB表達量顯著升高（P<0.05），這些增加的CKMB可能主要是在缺氧刺激之下細胞內(nèi)有氧能量代謝受阻，而無氧供能系統(tǒng)代償性增強的結(jié)果。本研究發(fā)現(xiàn)，in vitro心肌細胞在40min缺氧刺激后，胞內(nèi)和培養(yǎng)上清中CKMB和cTnI均呈升高趨勢。胞內(nèi)CKMB峰值出現(xiàn)在1h，而上清峰值在實驗結(jié)束時仍未檢測到，推測40min缺氧刺激引起心肌細胞內(nèi)能量鏈的連續(xù)性失調(diào)，使心肌收縮所需ATP短缺，激活了CK，代償心肌能量供應(yīng)。胞內(nèi)這種生理功能性反應(yīng)一直持續(xù)到1h，后減輕，48h后已低于即刻時間點。24h后上清CKMB濃度顯著低于胞內(nèi)（P<0.05），而48h后上清濃度高于胞內(nèi)。這種關(guān)系變化意味著1h后胞內(nèi)反應(yīng)以功能性恢復(fù)過程占主導(dǎo)，而胞外CKMB濃度變化的反應(yīng)要延遲。推測這可能與CKMB分子量較大（85kD），溢出細胞的速度受限有關(guān)。

心肌受缺氧刺激可以通過不同信號傳導(dǎo)途徑引起細胞的復(fù)雜反應(yīng)。一方面缺氧使線粒體內(nèi)ATP酶內(nèi)的電子傳遞鏈阻滯，大量電子漏出，不僅ATP產(chǎn)生受阻，而且產(chǎn)生大量自由基［8］，后者可氧化胞膜的脂質(zhì)雙分子層，破壞胞膜完整性。另一方面可以啟動細胞的保護過程，促進細胞因子表達。血管內(nèi)皮細胞生長因子（VEGF）表達增加，促進血管生成（angiogenesis），同時提高血管通透性（permeability）。由于心肌內(nèi)氧含量始終處于低氧狀態(tài)［7］，因此VEGF表達升高的生理效應(yīng)可以提高心肌組織的供氧效率，保護心肌。另外，缺氧可通過mTor途徑激活HIF-1基因，HIF-1表達一方面表明胞內(nèi)處于缺氧狀態(tài)，同時也強化了細胞的生存保護性生理反應(yīng)。缺氧也可通過AMPK途徑使蛋白質(zhì)和糖原的合成增加，胞內(nèi)CKMB升高可能也是心肌細胞對于缺氧刺激的生理反應(yīng)的結(jié)果之一［9］。故推測本研究中上清CKMB就是胞膜被自由基破壞后，從胞漿內(nèi)滲出的結(jié)果。

本研究證實，缺氧40min后胞內(nèi)cTnI表達量顯著高于上清（P<0.05），且這種趨勢從缺氧后即刻一直持續(xù)到1h后。而在1h到48h的三個時間點上，二者關(guān)系發(fā)生了倒轉(zhuǎn)，在24h和48h，胞內(nèi)cTnI濃度均低于上清。細胞內(nèi)、外cTnI的實時濃度的時間差比CKMB明顯，且內(nèi)、外濃度的連續(xù)性變化呈近似同步性。推測這與cTnI分子量23kD）較CKMB小有關(guān)。就二者而言，胞內(nèi)對缺氧刺激發(fā)生最強反應(yīng)的時間點在45min～1h，而上清中cTnI的峰值發(fā)生在24h后，CKMB則不明顯。針對此結(jié)果，似乎上清中TnI比CKMB更能實時反映胞內(nèi)情況。但考慮到CKMB反映的心臟的功能狀態(tài)，而cTnI僅是體現(xiàn)心臟結(jié)構(gòu)的健康狀況，因此在實際應(yīng)用中，建議二者兼顧，更為全面。

正常心肌細胞內(nèi)“游離”cTnI是細肌絲新陳代謝的儲備庫”［1］。心肌是高活性組織，新陳代謝較旺盛，因此對胞漿內(nèi)cTnI濃度的變化敏感。推測在施加40min缺氧后，心肌細胞胞膜完整性被自由基破壞，胞內(nèi)“儲備庫”中部分“游離”的cTnI溢出胞膜，使細肌絲新陳代謝平衡被破壞。為維持細肌絲結(jié)構(gòu)完整性，新陳代謝需求壓力、HIF-1α參與的mTor胞內(nèi)信號途徑及缺氧刺激介導(dǎo)的p38MAPK信號傳導(dǎo)途徑的合力作用，激活了胞內(nèi)cTnI相關(guān)基因的表達，促使胞內(nèi) cTnI表達量升高［10，11］。cTnI基因應(yīng)激性表達啟動，胞內(nèi)45min后達到峰值，而上清中的峰值出現(xiàn)在24h后。兩個峰值出現(xiàn)的時間差意味著大量的cTnI駐留在胞內(nèi)，供心肌細胞在缺氧應(yīng)激時的生理功能所需，可能包括心肌收縮成分的更新、修復(fù)。這可能也是包括心肌細胞在內(nèi)所有結(jié)構(gòu)應(yīng)激時代償性反應(yīng)的一部分。結(jié)合cTnI在胞內(nèi)的存在形式和百分比這些事實，推測本研究檢測到的上清cTnI可能是以胞漿中“游離”形式的cTnI為主，但不能確定是否含有結(jié)構(gòu)性cTnI成分。

本實驗結(jié)果尚難對單純40min缺氧刺激對于in itro心肌細胞細肌絲的完整性是否會造成損傷得出明確結(jié)論。由本研究推測，馬拉松及鐵人三項等運動員賽后CKMB和cTnI一過性升高的部分原因是由于心肌細胞膜被自由基破壞并從心肌組織滲出。24～48h后，氧供有效恢復(fù)，自由基被清除，胞膜完整性得以修復(fù)，這些指標(biāo)即恢復(fù)正常。而對于心梗病人，其原因要復(fù)雜得多。其缺氧部位心肌組織長時間缺氧，推測其胞膜也不能得到及時的修復(fù)，cTnI漏出也不能及時終止，因此即使是新生的cTnI也會漏出，最終其收縮功能得不到有效的恢復(fù)。從這個意義上講，無論臨床病人還是長時間大強度運動項目的運動員心臟，最有效的保護措施之一就是在運動中和運動后盡可能保持、恢復(fù)心臟的氧供。

對于從事長時間大強度運動項目的運動員心臟健康的檢測和評價，目前尚無統(tǒng)一標(biāo)準，而借鑒臨床的近似標(biāo)準的弊端也顯而易見。如何確定CKMB和cTnI的變化同運動員心臟健康程度的關(guān)系仍然是疑問。本研究僅就單純?nèi)毖醮碳n vitro心肌細胞結(jié)構(gòu)和功能的影響進行了研究，但臨床及運動相關(guān)的cTnI和CKMB升高是復(fù)雜反應(yīng)的結(jié)果，能對心肌的結(jié)構(gòu)和功能造成重要影響的不僅僅有缺氧，年齡、血脂、生化因子的變化、能源物質(zhì)供應(yīng)等因素均應(yīng)考慮在內(nèi)［4，12］，我們將在后續(xù)的 in vivo研究中就相關(guān)問題進行研究、探討。

4 小結(jié)

單純?nèi)毖醮碳た蓪?dǎo)致in vitro心肌細胞釋放CKMB和cTnI。推測是在缺氧刺激后，生存應(yīng)激反應(yīng)啟動，胞內(nèi)功能和結(jié)構(gòu)相關(guān)基因被激活，表達量升高的結(jié)果；由于缺氧誘導(dǎo)心肌細胞膜的完整性被破壞或者是通透性增大等原因，使二者從胞內(nèi)漏出。但上述推論尚需研究予以證實。

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