牦牛血液銅鋅超氧化物歧化酶cDNA克隆測(cè)序

陳增國，毛德才，毛 亮，海思源，徐亞歐

（1.西南民族大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，四川 成都 610041；2.瀘州醫(yī)學(xué)院心肌電生理研究室，四川 瀘州 646000）

超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase）簡(jiǎn)稱SOD。1938年，Mann和Keilin首次從牛紅細(xì)胞中分離出一種含銅蛋白質(zhì)（Hemocuprein），1953年又從小牛等動(dòng)物肝中分離出肝銅蛋白。1968年，McCord和Fridovich等對(duì)Hemocuprein的功能進(jìn)行研究，由于能催化超氧陰離子O2.-的歧化反應(yīng)，因此將其命名為超氧化物歧化酶（SOD），超氧化物歧化酶的作用主要是專一地清除生物氧化中產(chǎn)生的超氧陰離子自由基（Superoxide radical，O2.-）等中間物的毒性，能有效地防御活性氧對(duì)生物體的毒害作用。

按SOD中金屬輔基的不同，可將其分為以下3類：第一類是Cu/Zn-SOD，主要存在于真核細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中；第二類為含有Fe、Mn或二者都有的Fe/Mn-SOD，F(xiàn)e-SOD主要存在于原核細(xì)胞和真核細(xì)胞的基質(zhì)中，Mn-SOD主要存在于原核細(xì)胞體、真核細(xì)胞的細(xì)胞漿和線粒體內(nèi)；第三類是NiSOD，在土壤鏈霉菌和藻青菌中發(fā)現(xiàn)。

1991年侯金泉等研究表明，不同生物的SOD含量有很大差別，就是同種生物的不同組織或同一組織的不同部位，其SOD含量也各不相同。其中SOD含量最豐富的是動(dòng)物肝臟組織，動(dòng)物血液中也富含SOD。因此，在生產(chǎn)實(shí)際中動(dòng)物Cu/Zn-SOD基本是從動(dòng)物血液的紅細(xì)胞中提取的。眾所周知，成熟的紅細(xì)胞內(nèi)沒有細(xì)胞核，那么紅細(xì)胞中的Cu/Zn-SOD是在成熟紅細(xì)胞中合成的，還是在其他細(xì)胞合成后轉(zhuǎn)運(yùn)到紅細(xì)胞中的呢？為此，本試驗(yàn)選擇牦牛血液作為研究對(duì)象，檢測(cè)牦牛血液中是否存在合成Cu/Zn-SOD的mRNA。

1 材料與方法

1.1 材料 牦牛新鮮血液取自四川省阿壩州紅原縣的純種牦牛，頸靜脈采血10mL，置-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

主要儀器及試劑：iCycler iQTM熒光定量PCR儀（Bio-Rad公司，美國）；凝膠成像系統(tǒng)Doc2000（Bio-Rad公司，美國）；Tgradient PCR 儀（Biometra公司，德國）。無水乙醇，瓊脂糖等購自Promga公司；分子量標(biāo)準(zhǔn)物 DL2000，Takara RNA PCR Kit（AMV）Ver.3.0試劑盒，DEPC、PCR 產(chǎn)物純化試劑盒，BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞，pGM-T PCR產(chǎn)物克隆試劑盒均購自北京天為時(shí)代公司。

1.2 方法

1.2.1 牦牛血液總RNA提取 取牦牛新鮮血液300 μL，采用trizol法提取總RNA，通過瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其純度。

1.2.2 PCR引物設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)奶牛Cu/Zn-SOD cDNA序列（序列號(hào)：NM 174615），用Primer 5軟件設(shè)計(jì)一對(duì)PCR引物，上游引物序列為5′-GGCGTCGTTT TCTCTACTTGGT-3′、下游引物序列為 5′-GTGCCACA GAGAATGTTTAT-3′（Ysod1、Ysod2），由四川英駿生物公司合成。擴(kuò)增片段大小為483bp。

1.2.3 cDNA第一條鏈合成和PCR擴(kuò)增 以提取的總RNA樣品為模板，Oligo-dT為引物，用AMV反轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA第一條鏈。反應(yīng)體系用Takara RNA PCR Kit（AMV）Ver.3.0試劑盒合成cDNA第一條鏈，其配置參考Takara RNA PCR試劑盒說明書。反應(yīng)條件為45℃反應(yīng)45min，99℃反應(yīng)5min，4℃保存。

以合成的第一條cDNA鏈為模板，以Ysod1、Ysod2為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

PCR 反應(yīng)體積 50μL，包括 2μLMgCl2，5μL 10×PCR Buffer，0.25 μL ExTaq，1 μL dNTP，0.5 μL Ysod1，0.5μL Ysod2，2μL RT產(chǎn)物，38.75μL去離子水。94℃預(yù)變性2 min，然后進(jìn)入PCR循環(huán)，58.5℃退火30 s、72℃延伸1min，進(jìn)行40個(gè)循環(huán)，4℃保存，用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.2.4 RT-PCR產(chǎn)物克隆測(cè)序 按pBS-T PCR產(chǎn)物克隆試劑盒提供的方法將PCR產(chǎn)物與載體連接后轉(zhuǎn)化到大腸桿菌TOP10感受態(tài)細(xì)胞，逐一挑取單個(gè)白色菌落，接種于LB培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)后取菌液進(jìn)行PCR鑒定，所得條帶與RT-PCR擴(kuò)增條帶大小相同。挑選經(jīng)過PCR、凝膠電泳檢測(cè)為陽性的菌液交由四川省成都市英駿生物公司測(cè)序。

2 結(jié)果及分析

2.1 牦牛血液總RNA提取 對(duì)從牦牛血液中提取的總RNA樣品進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果見圖1。由圖1可見，從牦牛血液中提取的總RNA電泳后可見一條較淺的28S的RNA譜帶，這與本實(shí)驗(yàn)室毛德才從牦牛肝臟組織樣品中提取的總RNA存在28S、18S、5S譜帶有明顯的不同（圖2）。

2.2 牦牛Cu/Zn-SOD RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳后，獲得1條大小約為483bp的特異性條帶，與預(yù)期目標(biāo)片段大小基本一致，見圖3。

圖1 牦牛血液總RNA樣品電泳圖

圖2 牦牛肝臟總RNA電泳結(jié)果

圖3 RT-PCR產(chǎn)物凝膠電泳圖

2.3 牦牛Cu/Zn-SOD T-A克隆鑒定 將RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物按少量DNA膠回收說明書進(jìn)行回收后，取5 μL回收產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳，出現(xiàn)一條較純的目的片段，說明膠回收成功。膠回收產(chǎn)物與pGM-T載體連接后，轉(zhuǎn)化到宿主菌TOP10并涂在含有Amp的LB固體平板上，37℃培養(yǎng)過夜，隨機(jī)挑取白斑轉(zhuǎn)到含100 mM Amp的LB液體培養(yǎng)基中搖轉(zhuǎn)培養(yǎng)過夜，然后以菌液為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)鑒定重組結(jié)果。

2.4 重組子的PCR鑒定 挑選白色菌落，接種于LB液體培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，以菌液中的重組子為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳后發(fā)現(xiàn)PCR擴(kuò)增片段位于約483bp處，與RT-PCR產(chǎn)物電泳圖一致，初步確定克隆成功（見圖4）。

2.5 克隆產(chǎn)物測(cè)序 挑選經(jīng)過PCR、凝膠電泳檢測(cè)為陽性的菌液交由四川省成都市英駿生物公司測(cè)序，結(jié)果得出測(cè)序片段大小為483bp。經(jīng)比較，與毛德才從牦牛肝臟組織中獲得的cDNA序列完全一致。

圖4 重組子PCR鑒定結(jié)果圖

3 小結(jié)與討論

通過對(duì)比牦牛血液總RNA樣品電泳圖和牦牛肝臟組織總RNA電泳圖，發(fā)現(xiàn)牦牛血液樣品總RNA樣品電泳圖可見一條較淺的28S RNA譜帶，因此證實(shí)了牦牛血液中的RNA含量很低。

本試驗(yàn)選取高原畜種牦牛為研究對(duì)象，從牦牛血液中提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄克隆了牦牛Cu/Zn-SOD cDNA，經(jīng)測(cè)序，片段大小為483bp。證實(shí)該序列是牦牛SOD的cDNA序列。

由于成熟的紅細(xì)胞中沒有細(xì)胞核，因此并不具備合成SOD的條件，但是本試驗(yàn)卻從牦牛血液中提取到了少量SOD的mRNA。那么，牦牛血液中合成SOD的mRNA就可能有幾個(gè)來源：第一，可能是紅細(xì)胞還沒有成熟前就已經(jīng)合成了SOD蛋白質(zhì)；第二，可能是其他細(xì)胞合成后轉(zhuǎn)運(yùn)到紅細(xì)胞中的。而紅細(xì)胞中的具體來源還有待于進(jìn)一步研究證實(shí)。

[1]Mannt，Keilin D. Hemocuprein and hepatocuprein copper-protein compounds of blood and liverin mammals[J].Proe R SoeB，1938，126：303-315.

[2]McCord J M，F(xiàn)rodovich I.Superoxide dismutase.An enzymic function for erythrocuprein （hemocuprein）[J].Biol.Chem.，1969，244：6049-6055.

[3]李文杰.超氧化物歧化酶在治療超氧陰離子自由基所引起的疾病及抗衰老上的應(yīng)用 [J].中國藥學(xué)雜志，1989，24（7）：397-400.

[4]王慶莉，王居亮，陳德展.超氧化物歧化酶的理論研究進(jìn)展[J].山東師范大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2009，24（2）.

[5]侯金泉，等.十八種動(dòng)植物SOD含量探討[J].生化藥物雜志，1991，（2）：25.