景寧木蘭與木蘭屬其它植物之間親緣關(guān)系與遺傳基礎(chǔ)研究

蔣燕鋒，劉 饒，斯金平*

（1. 浙江林學(xué)院 林業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院，浙江 臨安 311300；2. 浙江省景寧縣科技開發(fā)服務(wù)部，浙江 景寧 323500）

景寧木蘭與木蘭屬其它植物之間親緣關(guān)系與遺傳基礎(chǔ)研究

蔣燕鋒1，劉 饒2，斯金平1*

（1. 浙江林學(xué)院 林業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院，浙江 臨安 311300；2. 浙江省景寧縣科技開發(fā)服務(wù)部，浙江 景寧 323500）

采用ISSR（Inter simple sequence repeat）分子標(biāo)記研究景寧木蘭（Magnolia sinostellata）與17個(gè)木蘭科木蘭屬其它植物之間的親緣關(guān)系，揭示景寧木蘭的遺傳基礎(chǔ)。在本試驗(yàn)條件下，從120個(gè)ISSR引物中篩選出20個(gè)具有多態(tài)性的引物，共檢測到178條清晰的條帶，其中163條具有多態(tài)性，占91.60%。通過POPGENE 32軟件分析，除了木蘭亞屬的山玉蘭獨(dú)自成一類外，符合赫欽生的木蘭屬分類系統(tǒng)：厚樸、廣玉蘭及其變種為木蘭亞屬一類，其余包括景寧木蘭、天目木蘭、武當(dāng)木蘭等為玉蘭亞屬一類；玉蘭與辛夷的雜交種二喬木蘭與辛夷的遺傳距離最近，為0.231 4，與玉蘭的遺傳距離也只有0.316 7；木蘭屬內(nèi)遺傳距離最近的為天目木蘭與日本辛夷，為2.232 1，遺傳距離最遠(yuǎn)的為山玉蘭與日本辛夷，為0.736 9；景寧木蘭與本屬其它植物間的遺傳距離在0.278 2 ～ 0.610 9，其中與天目木蘭的遺傳距離最近，為0.278 2，與山玉蘭的遺傳距離最遠(yuǎn)，為0.610 9。這表明景寧木蘭具有其特有的遺傳基礎(chǔ)，且與天目木蘭親緣關(guān)系最近。

景寧木蘭；ISSR；遺傳關(guān)系

景寧木蘭（Magnolia sinostellata）是1984年發(fā)現(xiàn)、1989年定名的木蘭屬新種[1～2]，原分布區(qū)十分狹窄，至今僅在浙江省景寧畬族自治縣東坑鎮(zhèn)大張坑村與景寧林業(yè)總場草魚塘林場交界處（29.9° N、119.6° E）發(fā)現(xiàn)有自然分布，整個(gè)分布區(qū)約25 hm2，集中分布區(qū)僅0.2 hm2，種群數(shù)量少，剛發(fā)現(xiàn)時(shí)約有120株（叢），因該種具有較高的觀賞價(jià)值，后因一些個(gè)體木蘭園和養(yǎng)花愛好者盲目亂挖，現(xiàn)存野生植株約60株（叢），使該種剛剛發(fā)現(xiàn)就瀕臨滅絕。景寧木蘭的資源現(xiàn)狀及保護(hù)價(jià)值[3]在第一屆國際木蘭大會(huì)交流后引起有關(guān)專家的高度重視，被大會(huì)列為最有閃光點(diǎn)的報(bào)告之一[4]。浙江省也將該種列入珍稀瀕危植物名錄。本文采用ISSR[5]（Inter simple sequence repeat）分子標(biāo)記技術(shù)研究景寧木蘭與木蘭屬其它植物之間的親緣關(guān)系，揭示景寧木蘭的遺傳基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

供試材料為植物嫩芽。于杭州植物園采集17種木蘭科木蘭屬植物以及浙江景寧林業(yè)總場草魚塘林場的景寧木蘭嫩葉（表1），用硅膠干燥，－70℃冰箱存放備用。

表1 實(shí)驗(yàn)材料Table 1 Test material

1.2 方法

1.2.1 DNA提取 采用十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）—硅珠吸附法提取植物基因組DNA[6]，用NanoDrop微量分光光度計(jì)（ND-1000）測定DNA的純度和濃度。同時(shí)每個(gè)樣品取5μL，加1μL上樣緩沖液混合后，于0.8%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測[6]，在凝膠成像系統(tǒng)（Gel DocTM，Bio-Rad）下觀察并照相。

1.2.2 PCR擴(kuò)增 擴(kuò)增體系參考陳亮明等廣玉蘭ISSR-PCR反應(yīng)體系[7]，20μL體系：50 ng DNA模板，0.5μmol/L ISSR引物，100.0μmol/L dNTPs，1.5 mmol/L氯化鎂，1U Taq DNA聚合酶，10×PCR反應(yīng)緩沖液。PCR反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性5.0min；94℃變性30 s，引物最適退火溫度退火40 s；72℃延伸50 s，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸5.0 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物于10.0 g/L的瓊脂糖凝膠電泳檢測并于凝膠成像系統(tǒng)拍照分析。本實(shí)驗(yàn)在Perkin-Elmer 9700（PE9700）擴(kuò)增儀上進(jìn)行。

1.2.3 引物篩選 所用ISSR引物參考加拿大UBC大學(xué)提供的引物序列，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。引物先用一個(gè)模板DNA從100個(gè)ISSR引物中初篩。然后用4個(gè)模板DNA進(jìn)行復(fù)篩，篩選出條帶清晰而且具有多態(tài)性的引物，用于正式的PCR擴(kuò)增[8]。

1.2.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析 同一引物，同一位點(diǎn)，根據(jù)擴(kuò)增產(chǎn)物的有（1）無（0）得到二元資料，形成0,1矩陣。用POPGENE32軟件[9]進(jìn)行分析，計(jì)算遺傳相似系數(shù)，運(yùn)用UPMGA法構(gòu)建樹狀聚類圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 基因組DNA結(jié)果檢測與分析

獲取高質(zhì)量的基因組DNA是實(shí)驗(yàn)成功的關(guān)鍵步驟之一。本實(shí)驗(yàn)采用CTAB—硅珠法從植物嫩芽中提取模板DNA，經(jīng)過瓊脂糖凝膠電泳檢測，發(fā)現(xiàn)條帶十分清晰而且明亮無拖尾、背景干擾等現(xiàn)象，表明蛋白質(zhì)等雜質(zhì)去除較干凈，純度較高，經(jīng)測定260/280比值在1.8左右，其濃度、純度均符合實(shí)驗(yàn)要求。

2.2 ISSR引物篩選分析

隨機(jī)用1個(gè)樣品對120個(gè)引物進(jìn)行篩選，結(jié)果有較多引物都有擴(kuò)增，每個(gè)引物可擴(kuò)增出1 ～ 15條帶不等；再次對條帶清晰、主帶明顯的初篩引物進(jìn)行篩選，最終選用的20個(gè)引物（見表2）反應(yīng)穩(wěn)定、擴(kuò)增性強(qiáng)和重復(fù)性好。

2.3 ISSR多態(tài)性分析

篩選出的20個(gè)引物共檢測到178條帶，平均每條引物擴(kuò)增出8.9條帶，ISSR擴(kuò)增片段大約集中在300 ～ 1 500 bp。其中163條帶表現(xiàn)為多態(tài)性，占總條帶數(shù)的91.6%。擴(kuò)增出條帶最多的引物為809，共12條；條帶最少的是引物807；多態(tài)性最高的是引物899，多態(tài)率高達(dá)100%（表2）。圖1是引物810擴(kuò)增的結(jié)果。

圖1 引物810擴(kuò)增結(jié)果Figure 1 Amplification result with primer of 810

表2 引物序列及其擴(kuò)增結(jié)果Table 2 Primer sequence and amplification result

2.4 遺傳距離聚類分析

利用聚類分析軟件 POPGENE 32對ISSR-PCR擴(kuò)增所得的多態(tài)性位點(diǎn)進(jìn)行分析，計(jì)算得到17個(gè)樣品的Nei’s遺傳距離[10]及遺傳相似矩陣（圖2）。從聚類結(jié)果可以看出，17個(gè)樣本在系數(shù)為0.6左右明顯可分為3類：第一類僅有山玉蘭；第二類由厚樸及其變種凹葉厚樸和廣玉蘭及其變種狹葉荷花玉蘭組成；第三類則包含景寧木蘭、天目木蘭、日本辛夷、寶華玉蘭及其余的木蘭科植物。

圖2 木蘭科植物遺傳聚類圖Figure 2 Dedrogram of 17 species of Magnolia

與形態(tài)學(xué)分類對比分析，除了木蘭亞屬的山玉蘭獨(dú)自成一類外，符合赫欽生的木蘭屬分類系統(tǒng)：厚樸、廣玉蘭及其變種為木蘭亞屬一類，其余包括景寧木蘭、天目木蘭、武當(dāng)木蘭等為玉蘭亞屬一類；玉蘭與辛夷的雜交種二喬木蘭與辛夷的遺傳距離最近，為0.231 4，與玉蘭的遺傳距離也只有0.316 7。木蘭屬內(nèi)遺傳距離最近的為天目木蘭與日本辛夷，為0.232 1，遺傳距離最遠(yuǎn)的為山玉蘭與日本辛夷，為0.736 9。景寧木蘭與本屬其它植物間的遺傳距離在0.278 2 ～ 0.610 9，其中與天目木蘭的遺傳距離最近，為0.278 2，與山玉蘭的遺傳距離最遠(yuǎn)，為0.610 9。表明景寧木蘭具有其特有的遺傳基礎(chǔ)，且與天目木蘭親緣關(guān)系最近。

3 討論

景寧木蘭喜溫暖濕潤、水分充足的環(huán)境，其樹形呈灌木狀，叢生，葉片較小，特別是花被輪多數(shù)、花被片數(shù)量多，顏色紫紅色至淡紅色，且株間存在較大差異，花被片倒披針形或倒卵狀匙形，不僅具有直接園藝開發(fā)的價(jià)值，而且具有木蘭科植物間雜交、景寧木蘭自身誘變育種等諸多方面的價(jià)值。

分子標(biāo)記技術(shù)用于種質(zhì)鑒定具有不受栽培環(huán)境影響的優(yōu)勢，對珍貴瀕危的景寧木蘭的遺傳結(jié)構(gòu)和遺傳地位的研究具有非常重要的意義。

本研究運(yùn)用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)對景寧木蘭與其它17種木蘭屬植物的遺傳結(jié)構(gòu)研究表明，木蘭屬內(nèi)各植物之間具有較大的遺傳差異，遺傳基礎(chǔ)較寬。厚樸及其變種凹葉厚樸和廣玉蘭及其變種狹葉荷花玉蘭之間遺傳距離較近；二喬木蘭、辛夷（紫玉蘭）和玉蘭三者間的遺傳距離也比較近，這與其形態(tài)特征的相似相對應(yīng)，特別是二喬木蘭，是辛夷與玉蘭的雜交種。相比之下，景寧木蘭與山玉蘭的遺傳距離最遠(yuǎn)，親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，而與天目木蘭的遺傳距離最近，親緣關(guān)系也最近。

[1] 裘寶林，陳征海. 浙江木蘭屬新種[J]. 植物分類學(xué)報(bào)，1989，27（1）：79－80.

[2] 斯金平，蔡通愛. 珍稀瀕危植物景寧木蘭[J]. 浙江林業(yè)科技，1998，18（1）：68－71.

[3] SI Jin-ping. Protection and Development of Magnolia sinostellata[A]. Proceedings of the International Symposium on the Family Magnoliaceae[C]. Beijing：Science Press，2000. 272－273.

[4] Richard B Figlar. South China: Its Magnolias and the 1998 Intermational Symposium on the Family Magnoliaceae[J]. MAGNOLIA, 1999（66）：1－17.

[5] Zietkiewicz E，Rafalski A，Labuda D. Genome fingerprinting by simple sequence repeat (ISSR)anchored polymerase chain reaction amplification[J]. Genomics，1994（20）：176－183.

[6] Assefa K，Merker A，Teffera H. Inter simple sequence repeat (ISSR) analysis of genetic diversity in tef (Eragrostistef (Zucc.) Trotter). Hereditas，2003（139）：174－183.

[6] Sambrook J，F(xiàn)ritsch E F，Maniatis T. Molecular cloning: a Laboratory Manual[M]. New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989. [7] 陳亮明，相陽，張冬林，等. 兩種方法對廣玉蘭ISSR-PCR反應(yīng)體系的優(yōu)化比較[J]. 種子，2008，27（6）：10－14.

[8] Zhao W G，Miao X X，Zang B，et al. Construction of fingerprinting and genetic diversity of mulberry cultivars in china by ISSR markers[J]. Acta Gen Sin，2006，33（9）：851－860.

[9] Yeh FC，Yang RC，Boyle TBJ，et al. Popgene version 1.32, the user-friendly shareware for population genetic analysis[Z]. Molecular Biology and Biotechnology Centre, University of Alberta, Edmonton，1999.

[10] Nei M，Li W H. Mathematical models for studding genetic variation in terms of restriction endonucleases[J]. Proc Nat Acad Sci USA，1979（76）：5 269－5 273.

Study on Genetic Relation among Magnolia sinostellata and Other Species of Magnolia

JIANG Yan-feng1，LIU Rao2，SI Jin-ping1
（1. School of Forestry and Biological Technology, Zhejiang Forestry University, Lin’an 311300, China; 2. Jingning Science and Technology Extension Station of Zhejiang, Jingning 323500, China）

Study was conducted on genetic relation among Magnolia sinostellata and other 16 species of Magnolia by inter simple sequence repeat (ISSR). 20 polymorphism primers were selected from 120 primers, and 193 bands were detected, of which 160 polymorphism. POPGENE 32 was used to calculate the genetic distance among these plants. Result showed that the polymorphism ratio was 82.90%, and the distance between M. sinostellata and other Magnolia ranged from 0.278 2 ( M. amoena) to 0.610 9(M. delavayi).Unweighted pair-group mean analysis (UPGMA) grouped them into three clusters: M. amoerna; M. officinalis, M. grandiflora and their varieties; M. sinostellata, M. amoena, M. sprengeri and so on. The results suggested that M. sinostellata had close genetic relation with M. amoena, M. kobus and M. zenii.

Magnolia sinostellata; ISSR; genetic relation

S718.3

1001-3776（2010）02-0022-04

2009-11-20；

2010-02-08

浙江省重大科技計(jì)劃項(xiàng)目（2005C32052）

蔣燕鋒（1984－），男，浙江嘉興人，碩士研究生，從事藥用植物遺傳研究；*通訊作者。