油茶種子總RNA提取及Cod8FAD基因的鑒定

胡 姣，譚曉風(fēng)，張 琳，龍洪旭

（中南林業(yè)科技大學(xué)林學(xué)院 經(jīng)濟(jì)林育種與栽培國(guó)家林業(yè)局重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長(zhǎng)沙 410004）

油茶種子總RNA提取及Cod8FAD基因的鑒定

胡 姣，譚曉風(fēng)*，張 琳，龍洪旭

（中南林業(yè)科技大學(xué)林學(xué)院 經(jīng)濟(jì)林育種與栽培國(guó)家林業(yè)局重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長(zhǎng)沙 410004）

油茶種子胚乳中富含脂肪、多糖和酚類公合物，要獲得高質(zhì)量的RNA難度較大。本研究以油茶優(yōu)良無(wú)性系湘林1號(hào)近成熟種子的胚乳為實(shí)驗(yàn)材料，在試劑盒的基礎(chǔ)上應(yīng)用改良的CTAB法提取總RNA。結(jié)果表明，使用改良后的CTAB法配合試劑盒提取RNA操作簡(jiǎn)單，且能夠有效去除油茶種子中多糖和多酚類等次生物質(zhì)，從而得到高質(zhì)量的RNA。以獲得的RNA為模板，設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物，通過(guò)RT-PCR，成功從油茶種子中鑒定出了油脂合成的關(guān)鍵酶基因之一△8脂肪酸脫飽和酶基因，命名為Cod8FAD（Camellia oleifera delta 8 fatty acid desaturase），該基因與茶樹△8脂肪酸脫飽和酶基因相似性最高，為97%，與耬斗菜△8脂肪酸脫飽和酶基因相似性最低，為62%。

油茶；RNA提??；改良CTAB法；RT-PCR

植物組織中總RNA的提取是植物分子生物學(xué)研究的基本技術(shù)之一，高質(zhì)量RNA的獲得是進(jìn)行RT-PCR、Northern blot、cDNA文庫(kù)構(gòu)建等分子生物學(xué)研究的前提條件[1]。關(guān)于從植物組織中提取RNA方法的研究報(bào)道很多，但專門針對(duì)油茶或油茶不同器官總RNA提取的有效方法報(bào)道較少，這在很大程度上制約了相關(guān)研究的深入開(kāi)展。目前，提取RNA的方法主要有異硫氰酸胍法、冷酚法、熱酚法、SDS/酚抽提法和TRIZOL法等[1～4]。一般說(shuō)來(lái)，不同的植物材料必須經(jīng)過(guò)摸索合適的取材時(shí)間和采取不同的RNA提取方法。

油茶是我國(guó)南方重要的木本油料樹種，與油棕、油橄欖和椰子并稱為世界四大木本食用油料樹種。茶油主要由油酸、亞油酸等對(duì)人體健康有益的不飽和脂肪酸組成，而控制這些不飽和脂肪酸合成的關(guān)鍵酶基因主要在油茶種子中表達(dá)。但由于油茶種子中胚乳含有大量的脂肪、多糖和酚類化合物，找到一種行之有效的提取油茶種子RNA的方法至關(guān)重要，是順利進(jìn)行后續(xù)油茶油脂合成關(guān)鍵酶基因克隆等實(shí)驗(yàn)的前提條件。作者經(jīng)過(guò)反復(fù)摸索將傳統(tǒng)的CTAB法進(jìn)行改良，應(yīng)用于油茶種子RNA的提取，并與試劑盒提取法進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)改良的CTAB法所提取的RNA不但質(zhì)量高，且簡(jiǎn)單快速，能滿足基因克隆等分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)的要求。以提取的RNA為模板，成功鑒定出一條油茶油脂合成的關(guān)鍵酶基因——△8脂肪酸脫飽和酶基因。這對(duì)其它木本植物總RNA的提取及基因克隆等有一定的指導(dǎo)和借鑒意義。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

于9月底至10月初，采集油茶優(yōu)良無(wú)性系湘林1號(hào)的發(fā)育中的種子為實(shí)驗(yàn)材料，于－70℃超低溫冰箱保存。

1.2 主要實(shí)驗(yàn)用品及處理

由于空氣中及人體普遍存在RNase，且不易變性，所以提取植物的RNA時(shí)要避免污染，防止降解。在提取前做下列準(zhǔn)備工作：將研缽、100 mL/250 mL量筒、250 mL/100 mL容量瓶、10 mL/25 mL移液管、藥匙、試劑瓶等玻璃制品均用錫紙包裹口部，置于烤箱內(nèi)185℃，6 h；50 mL/1.5 mL離心管、吸頭等塑料制品用1‰DEPC水浸泡過(guò)夜后，120℃高壓滅菌20 min×2次；電泳槽及電泳托、梳子用3%雙氧水處理10 ～ 15 min。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 試劑盒提取RNA法 采用的RNA提取試劑盒分別為Ambiogen公司和Invitrogen公司的植物RNA純化試劑盒，操作方法分別按照各公司的說(shuō)明書進(jìn)行。

1.3.2 改良的CTAB法提取RNA

1.3.2.1 基于Ambiogen試劑盒改良的CTAB法 ①將裝有研磨好的凍干樣品的1.5 mL離心管從－70℃取出，立即加65℃預(yù)熱好的600 μL的CTAB裂解緩沖液，渦旋混勻，65℃保溫10 min，并每隔2 ～ 3 min渦旋振蕩1次；②加200 μL的5 M KAC，然后加600 μL的氯仿/異戊醇（24：1），渦旋振蕩5 min，冰浴10 min，使其充分裂解；③取450 μL上清液，加入450 μL的RLT溶液，高速離心（13 000 ～ 14 000 rpm）2 min，將上清轉(zhuǎn)移到含收集管的過(guò)濾柱內(nèi)，12 000 rpm離心1 min，將收集管里的溶液（約450 μL）轉(zhuǎn)移到DEPC處理過(guò)的1.5 mL的離心管中；④加入約0.5倍體積無(wú)水乙醇，輕輕混勻；⑤后續(xù)步驟按試劑盒中說(shuō)明操作。

1.3.2.2 基于Invitrogen試劑盒改良的CTAB法 ①將裝有研磨好的凍干樣品的1.5 mL離心管從－70℃取出，立即加65℃預(yù)熱好的600 μL的CTAB裂解緩沖液，渦旋混勻，65℃保溫10 min，并每隔2 ～ 3 min渦旋振蕩1次；②加200 μL的5 M KAC，然后加600 μL的氯仿/異戊醇（24：1），渦旋振蕩5 min，冰浴10 min，使其充分裂解；③4℃ 12 000 rpm離心2 min；④將上清液轉(zhuǎn)入一DEPC水處理的1.5 mL離心管中，重復(fù)離心1次以徹底去除組織殘片；⑤取450 μL上清液，加450 μL的kit提供的lysis buffer，接著加450 μL的無(wú)水乙醇，分別用槍頭吸打并渦旋混勻（握于手中上下晃動(dòng)3 min）；⑥后續(xù)步驟按試劑盒中說(shuō)明操作。

1.4 總RNA純度及完整性檢測(cè)

電泳分析：取2 μL的RNA樣品與1 μL溴酚藍(lán)混合后進(jìn)行1.0%瓊脂糖凝膠電泳，電壓為100 V的條件下電泳30 min，在紫外凝膠成像系統(tǒng)上觀察RNA條帶的清晰度和完整性并拍照。

參照奧斯伯等的方法，取10 μL總RNA溶液，加DEPC水稀釋至1 mL，分別在230、260和280 nm測(cè)吸光值。并計(jì)算A260/A280、A260/A230的比值。

RNA產(chǎn)量（μg）= RNA濃度（μg/mL）×VDEPC－H2O（mL）

1.5 反轉(zhuǎn)錄PCR（RT-PCR）

根據(jù)GenBank基因庫(kù)中已公布的高等植物（向日葵、油菜、擬南芥、琉璃苣等）的△8脂肪酸脫飽和酶基因的氨基酸序列，進(jìn)行序列比對(duì)，確定保守區(qū)I和保守區(qū)II，根據(jù)這兩個(gè)保守區(qū)分別設(shè)計(jì)上游簡(jiǎn)并引物PF（5’-GATTGGRBBAAAGASCATCC-3’）和下游簡(jiǎn)并引物PR（GTTATGVKTCCATTTCCACCA）。以獲得的油茶種子RNA為模板，使用Fementas公司的cDNA合成試劑盒反轉(zhuǎn)錄（RT）合成第一鏈cDNA，再以此第一鏈cDNA為模板，使用PF和PR引物組合進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增條件為：94℃預(yù)變性4 min；94℃變性30 s；55℃退火30 s；72℃延伸90 s；35個(gè)循環(huán)；72℃延伸7 min。4℃保存?zhèn)溆?。? μL擴(kuò)增產(chǎn)物，經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳，觀察記錄結(jié)果。

1.6 克隆、測(cè)序及序列分析

對(duì)目標(biāo)PCR產(chǎn)物進(jìn)行回收、TA克隆，DNA測(cè)序，對(duì)獲得的DNA序列和推導(dǎo)氨基酸序列進(jìn)行Blast分析，確定獲得的基因類型。

2 結(jié)果與分析

圖1 不同方法提取的油茶種子總RNAFigure 1 Total RNA isolated from C. oleifra by different methods

2.1 不同方法提取的油茶種子總RNA質(zhì)量分析

使用幾種不同的方法，都可以從油茶種子中提取出總RNA，但通過(guò)電泳分析發(fā)現(xiàn)，獲得的RNA條帶的完整性和強(qiáng)度都有差別（圖1）。圖1-1為使用Ambiogen試劑盒提取的RNA，28 s和18 s條帶模糊，無(wú)5.8 s，說(shuō)明使用該試劑盒提取RNA時(shí)，樣品組織中的RNA大部分降解。圖1-2為使用Invitrogen試劑盒提取的RNA，28 s和18 s條帶比較清晰，但亮度較弱，沒(méi)有5.8 s，說(shuō)明樣品組織中的RNA仍有小部分降解。圖1-3為使用改良的CTAB法，Ambiogen試劑盒提取的RNA三條帶完整，但28 s與18 s亮度相當(dāng)，5.8 s亮度較弱，28 s上方有殘留DNA，有可能是由于試劑原因致使未清洗干凈。圖1-4顯示：使用改良的CTAB法，使用Invitrogen試劑盒提取的RNA，三條帶完整，帶型較好，28 s的亮度是18 s的2倍左右，并且5 s亮度較弱，說(shuō)明該樣品完整性良好，未發(fā)生明顯的降解。

上述4種方法的RNA提取結(jié)果表明，使用Invitrogen試劑盒配合改良的CTAB法所提取的RNA樣品完整性好，未發(fā)生降解，即該方法適合提取高質(zhì)量的油茶種子總RNA。

2.2 不同方法提取的油茶種子總RNA的純度和得率

表1 不同方法提取的RNA的純度及得率比較Table1 Comparison of isolated RNA purity and yield by different methods

從表1可以看出，4種方法提取的RNA的OD260 nm/OD280 nm的值均在1.8 ～ 2.0，說(shuō)明沒(méi)有蛋白質(zhì)或酚類污染，符合要求。而OD260 nm/OD230 nm的值只有使用Invitrogen試劑盒配合改良的CTAB法為2.109，大于2.0，說(shuō)明樣品受離子和小分子的干擾少，多糖的去除較為干凈符合要求，其余3種方法的OD260 nm/OD230 nm均小于2.0，表明有小分子和鹽存在。4種方法提取的RNA產(chǎn)率均較大。

2.3 油茶Cod8FAD基因的鑒定

以4種不同方法所提取的油茶種子總RNA為模板進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)，引物是根據(jù)不同植物△8脂肪酸脫飽和酶基因序列比對(duì)而設(shè)計(jì)的簡(jiǎn)并引物PF和PR，根據(jù)PF和PR所處基因的位置，推測(cè)其跨越的區(qū)域約為500 bp。RT-PCR結(jié)果見(jiàn)圖2。從4種方法提取的RNA中均獲得了擴(kuò)增條帶，且?guī)拖嗤鶠?條帶，大小分別為500 bp左右和300 bp左右。但4個(gè)樣品中，3號(hào)和4號(hào)的條帶亮度要明顯強(qiáng)于1號(hào)和2號(hào)，反映出使用改良CTAB法提取的RNA質(zhì)量要明顯好于常規(guī)方法提取的RNA。根據(jù)之前的推測(cè)，500 bp的條帶應(yīng)該是目的片段。對(duì)目的條帶進(jìn)行回收、連接、轉(zhuǎn)化、測(cè)序，獲得了486 bp的核苷酸序列，并推導(dǎo)編碼162個(gè)氨基酸（圖3），以此氨基酸序列在Genbank基因庫(kù)中進(jìn)行Blast分析，結(jié)果檢索到多條與其高度同源的△8脂肪酸脫飽和酶基因序列（圖4）。該基因與茶樹△8脂肪酸脫飽和酶基因相似性最高，為97%；與耬斗菜△8脂肪酸脫飽和酶基因相似性最低，為62%。該基因系首次從油茶中鑒定，命名為Cod8FAD（Camellia. oleifera delta 8 fatty acid desaturase）。

圖2 不同方法提取的RNA的RT-PCR擴(kuò)增Figure 2 RT-PCR using RNA template isolated by different methods

圖3 油茶Cod8FAD基因的DNA序列和氨基酸序列Figure 3 DNA sequence and amino acid sequence of Cod8FAD

圖4 RT-PCR產(chǎn)物的氨基酸序列Blast分析Figure 4 Blast analysis of amino acid sequence of RT-PCR product

3 討論

不同植物或同種植物不同組織所含化學(xué)物質(zhì)的成分有很大差別，因此其RNA提取的方法也不盡相同[5～6]。油茶種子含有大量的脂肪、多糖和酚類化合物，如果RNA提取過(guò)程中蛋白質(zhì)去除不干凈，往往造成其污染，使RNA的質(zhì)量下降；由于酚類化合物的存在，RNA提取過(guò)程中極易產(chǎn)生褐化效應(yīng)，氧化的酚類化合物（如醌類）可以與RNA不可逆地結(jié)合，導(dǎo)致RNA的降解及其活性的喪失，形成不溶性復(fù)合物，多糖能與RNA共沉淀或形成難溶的膠狀物，還能抑制許多酶的活性[7～11]；研究表明，CTAB法能夠有效去除油茶胚乳中多糖、酚類物質(zhì)和基因組DNA的影響，提取出高質(zhì)量的總RNA。CTAB是一種陽(yáng)離子強(qiáng)去垢劑，具有疏水性基團(tuán)和親水性基團(tuán)，當(dāng)CTAB透過(guò)細(xì)胞壁后，其疏水性基團(tuán)十六烷基能與細(xì)胞膜中的脂質(zhì)結(jié)合，而親水性陽(yáng)離子可與膜中的蛋白質(zhì)結(jié)合，裂解細(xì)胞膜，打通細(xì)胞，使細(xì)胞失水，促進(jìn)核酸物質(zhì)釋放出胞外。提取時(shí)，CTAB可與DNA和RNA結(jié)合成復(fù)合物，此類復(fù)合物在高鹽下可溶，低鹽下沉淀，然后用氯仿/異戊醇去除蛋白質(zhì)。在提取RNA時(shí)，CTAB同時(shí)具有結(jié)合糖類的作用，此法是目前公認(rèn)的提取含較多多糖和次生代謝物的植物組織RNA的較好方法[12～13]。

根據(jù)結(jié)果分析得知，無(wú)論使用何種試劑盒，最關(guān)鍵的是要將油茶胚乳中的多糖、酚類去除干凈，得到的RNA帶型好，亮度高，得率也高。使用提取的RNA，通過(guò)RT-PCR，發(fā)現(xiàn)RNA質(zhì)量高的樣品獲得的PCR產(chǎn)物產(chǎn)量也高。對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)一步克隆、測(cè)序、序列分析，鑒定出了一條油茶種子中表達(dá)的△8脂肪酸脫飽和酶基因，該基因在油茶油脂不飽和脂肪酸的合成中起著重要作用，因而為油茶定向分子育種提供了技術(shù)基礎(chǔ)。

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信息

2009年浙江省可食林產(chǎn)品質(zhì)量安全抽查合格率達(dá)97.4%

為加強(qiáng)浙江省可食林產(chǎn)品的質(zhì)量安全監(jiān)管，保障可食林產(chǎn)品的質(zhì)量安全，維護(hù)消費(fèi)者的利益和社會(huì)的穩(wěn)定，按照《關(guān)于開(kāi)展2009年全省可食林產(chǎn)品質(zhì)量安全抽查的通知》（浙林辦科〔2009〕33號(hào)）規(guī)定，浙江省林業(yè)廳組織浙江省林產(chǎn)品質(zhì)量檢測(cè)站等質(zhì)檢機(jī)構(gòu)對(duì)全省可食林產(chǎn)品質(zhì)量安全進(jìn)行了抽查。

2009年共抽查食用筍（春筍、鞭筍、冬筍、早筍、筍干）、干果（山核桃、香榧、白果）、山地水果（楊梅、柑橘、獼猴桃）、食用菌（香菇、黑木耳）4大類13種可食林產(chǎn)品1 093批次，樣品按生產(chǎn)基地與市場(chǎng)比例為8：2抽取，涉及全?。闻d、舟山除外）9個(gè)地區(qū)。經(jīng)檢測(cè)，合格1 065批次，抽查合格率達(dá)97.4%。按產(chǎn)品分類統(tǒng)計(jì)，各類產(chǎn)品抽查合格率分別為食用筍96.7%、山地水果99.3%、干果94.1%、食用菌100%。抽查結(jié)果表明，浙江省上述可食林產(chǎn)品質(zhì)量安全狀況總體較好。

（摘自：http://www.zjly.gov.cn:8080/snyw/11951.htm）

Extraction of Total RNA and Identification of Cod8FAD Gene in Camellia oleifera seeds

HU Jiao，TAN Xiao-feng，ZHANG Lin，LONG Hong-xu（Key Lab of Non-wood Forest Products of State Forestry Administration, College of Forestry, Central South University of Forestry and Technology, Changsha 410004, China）

The isolation of high quality RNA from Camellia oleifera seeds had been very difficult because of rich polysaccharide and phenol compounds in endosperm. Using maturescent seeds of Xianglin No.1, an improved clone as test materials, the total RNA was isolated by modified CTAB combined with RNA purification Kit. Purity and concentration of isolated RNA indicated that polysaccharide and phenol compounds could be effectively eliminated in the endosperm by this method. Using the high-quality RNA as template, a key gene for lipid synthesis was successfully identified by degenerate RT-PCR, that was named Cod8FAD (C. oleifera delta 8 fatty acid desaturase), similar (97%) with delta 8 fatty acid desaturase of C. sinensis.

Camellia oleifera; RNA extraction; modified CTAB method; RT-PCR

S759.3

1001-3776（2010）02-0017-05

2009-12-09；

2010-02-17

國(guó)家“十一五”科技支撐項(xiàng)目（2009BADB1B02，2006BAD18B0204）

胡姣（1984－），女，湖南株洲人，碩士研究生，從事林木遺傳育種研究；*通訊作者。