Rack 1對慢性嗎啡成癮小鼠海馬BDNF表達(dá)和動(dòng)物行為偏愛的影響＊

蘇嵐 萬莉紅,2 謝一舟 汪宇輝 劉延友 王正榮△

(1.四川大學(xué)華西基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與法醫(yī)學(xué)院時(shí)間生物學(xué)衛(wèi)生部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,四川 成都 610041;2.四川大學(xué)華西基礎(chǔ)與法醫(yī)學(xué)院藥理教研室,四川 成都 610041)

目前我國藥物濫用所致成癮的人數(shù)日益增多,其機(jī)制主要與一些神經(jīng)遞質(zhì)的紊亂和失調(diào)有關(guān)[1],且這些藥物通過不同通路激活大腦中的獎(jiǎng)賞中樞即中腦邊緣多巴胺系統(tǒng)[2]。海馬主要通過乙酰膽堿、5-羥色胺等神經(jīng)遞質(zhì)參與腦的學(xué)習(xí)記憶過程[3],大量研究證實(shí)藥物依賴的實(shí)質(zhì)是一個(gè)惡性學(xué)習(xí)記憶過程,通過影響神經(jīng)遞質(zhì)及受體導(dǎo)致學(xué)習(xí)記憶功能不同程度的下降[3]。同時(shí)研究發(fā)現(xiàn)酒精依賴可以導(dǎo)致大腦中腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)表達(dá)的改變,這一作用過程是由C激酶受體1蛋白(Rack1)所介導(dǎo)的[4]。然而Rack1在慢性嗎啡所導(dǎo)致的藥物成癮過程中是否也有作用尚無報(bào)道。因此,本研究亦在探討Rack1在慢性嗎啡成癮小鼠海馬中的作用及初步分子機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

4～6周齡健康雄性ICR小鼠30只,由成都達(dá)碩動(dòng)物中心提供。小鼠飼養(yǎng)于22℃、55%的濕度、光暗循環(huán) 12：12的條件下,均可自由攝取食物和水。按照隨機(jī)分組原則,分為空質(zhì)粒+生理鹽水對照組(A),空質(zhì)粒+嗎啡成癮組(B),shRack1+嗎啡成癮組(C),每組10只。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

shRack1和對照質(zhì)粒由本實(shí)驗(yàn)室汪宇輝博士提供,鹽酸嗎啡(四川醫(yī)藥總公司),Trizol(Invitrogen),RT-PCR試劑盒(大連寶生物工程有限公司),引物(上海英駿生物技術(shù)有限公司)序列見表1,DL2000 DNA Marker(TaKaRa),鼠抗人 Rack1單抗、鼠抗羊BDNF單抗(Santa),兔抗鼠 IgG/HRP(中杉公司),免疫組化試劑盒(武漢博士德公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 條件性位置偏愛實(shí)驗(yàn)(CPP)測定嗎啡獎(jiǎng)賞效應(yīng)

預(yù)試期：小鼠自由活動(dòng)后第3d測試小鼠的天然傾向。將測試箱中的隔板打開,把小鼠放入白箱中,允許探索黑、白箱5min,記錄每只小鼠15min內(nèi)在白箱中的停留時(shí)間。

表1 引物序列

給藥及訓(xùn)練期：第4-11d給藥。用隔板封閉黑白箱通道。受試動(dòng)物10：00分別皮下注射生理鹽水(A組,10mg?kg-1)和嗎啡(B、C組,10mg?kg-1),放入白箱內(nèi)停留30min。次日全部注射生理鹽水,放入黑箱內(nèi)停留30min。并且每日16：00腦室注射空質(zhì)粒(A、B組)和 shRack1質(zhì)粒(C組)20μ l,共 8d。

測試期：第12d不給藥,打開中間隔板,將小鼠放入黑、白兩箱中間,讓其自由活動(dòng),記錄15min內(nèi)小鼠在白箱中停留時(shí)間。如果小鼠在白箱中停留的時(shí)間延長,表示它對該側(cè)偏愛。

1.3.2 RT-PCR測定海馬Rack1以及BDNF mRNA的表達(dá)

將小鼠處死,快速開顱取腦,碎冰上分離出海馬,按照試劑說明提取組織總RNA,用分光光度計(jì)鑒定總RNA樣品。取總RNA 2μ g,根據(jù)RT-PCR試劑盒說明書合成cDNA。Rack1 PCR擴(kuò)增條件為：變性 94℃2min;94℃30s,52℃30s,72℃2min,共30個(gè)循環(huán),72℃延伸8min。BDNF PCR擴(kuò)增條件為：變性94℃2min;94℃30s,51.4℃30s,72℃2min,共 30個(gè)循環(huán),72℃延伸8min。β-actin PCR擴(kuò)增條件為：變性94℃2min;94℃30s,52℃30s,72℃2min,共30個(gè)循環(huán),72℃延伸8min。PCR產(chǎn)物經(jīng)15g?L-1的瓊脂糖凝膠電泳,凝膠成像系統(tǒng)成像,Quantity One專業(yè)分析軟件讀取條帶灰度值(IOD值),以目的條帶和β-actin條帶的比值作為目的基因的相對表達(dá)量。

1.3.3 免疫組化測定海馬Rack1以及BDNF蛋白的表達(dá)

用4%的甲醛溶液將海馬組織標(biāo)本固定48h,等級脫水后石蠟包埋,切片,厚度約 3～5μ m。石蠟切片常規(guī)脫蠟,3%H202室溫孵育15min,以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶,熱抗原修復(fù)10min,室溫冷卻30min。10%正常山羊血清封閉 15min,滴加1：100稀釋的一抗 Rack1和BDNF,4℃過夜,二抗37℃孵育15min,滴加辣根酶標(biāo)記鏈酶卵白素工作液,37℃孵育15min,DAB顯色劑顯色5min,蘇木素復(fù)染,封片。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 shRack1對慢性嗎啡成癮小鼠CPP的影響

給藥前各組小鼠在白箱停留時(shí)間差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。給藥后與A組相比,B、C組小鼠在白箱停留時(shí)間明顯增加(P＜0.05),說明嗎啡成功誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生位置偏愛,而C組與B組相比,C組小鼠在白箱的停留時(shí)間較少(P＜0.05),說明shRack1抑制了嗎啡誘導(dǎo)的CPP效應(yīng)(見表2)。

表2 各組小鼠在白箱內(nèi)停留的時(shí)間(,n=10)

表2 各組小鼠在白箱內(nèi)停留的時(shí)間(,n=10)

△注：與 A 組相比,＊P＜0.05;與B組相比,△P＜0.05(下同)A：空質(zhì)粒+生理鹽水對照組,B：空質(zhì)粒+嗎啡成癮組,C：shRack1+嗎啡成癮組(下同)

組別 給藥前(s) 給藥后(s)A 255.500±172.062 297.330±111.182 B 294.600±58.282 794.800±64.363＊C 283.000±60.469 462.800±72.530△

2.2 shRack1對慢性嗎啡成癮小鼠海馬 Rack1以及BDNF mRNA表達(dá)的影響

與A組相比,B組的Rack1以及BDNF mRNA的表達(dá)明顯增高,說明嗎啡對其有促進(jìn)作用,C組與B組相比,Rack1 mRNA的表達(dá)下調(diào)(P＜0.05),說明 shRack1干擾成功,BDNF mRNA表達(dá)下調(diào),說明shRack1對其有抑制作用(見圖1、表 3)。

圖1 小鼠海馬Rack1和BDNF mRNA的電泳結(jié)果

表3 shRack1對慢性嗎啡成癮小鼠海馬Rack1和BDNFmRNA表達(dá)的影響±s,n=10)

表3 shRack1對慢性嗎啡成癮小鼠海馬Rack1和BDNFmRNA表達(dá)的影響±s,n=10)

組別 Rack1(OD) BDNF(OD)A 1.75±0.1 1.61±0.15 B 2.62±0.1＊ 2.25±0.2＊C 2.2±0.2△ 1.65±0.1△

2.3 shRack1對慢性嗎啡成癮小鼠海馬Rack1以及BDNF蛋白表達(dá)的影響

B組與A組相比,海馬區(qū)有陽性表達(dá),說明慢性嗎啡成癮可導(dǎo)致Rack1以及BDNF蛋白表達(dá)增加。C組與B組相比,海馬區(qū)的陽性表達(dá)明顯減少,說明shRack1干擾成功,且對BDNF蛋白表達(dá)有抑制作用(見圖2)。

圖2 小鼠海馬Rack 1和BDNF蛋白的表達(dá)情況(免疫組化SP×400)

3 討論

藥物成癮可看作是一個(gè)惡性學(xué)習(xí)記憶過程,產(chǎn)生成癮記憶[5]。海馬為腦內(nèi)學(xué)習(xí)記憶的主要器官[6],在藥物成癮過程中同樣發(fā)揮著重要作用。有研究表明,藥物成癮的相關(guān)大腦回路與已知的記憶存儲相關(guān)回路有很多相似之處,通過電刺激成癮模型大鼠海馬的谷氨酸豐富區(qū),會引起動(dòng)物對成癮藥物的強(qiáng)烈渴望,而刺激其它腦區(qū)則無效,進(jìn)一步說明了海馬記憶中心及其神經(jīng)回路在成癮過程中的關(guān)鍵作用[7]。

BDNF屬于神經(jīng)營養(yǎng)因子家族,又稱神經(jīng)營養(yǎng)素。主要分布在海馬、杏仁核和皮質(zhì),可通過靶源性、自分泌、旁分泌方式與神經(jīng)細(xì)胞上高親和性的酪氨酸激酶受體B(TrkB)以及低親和性的p75神經(jīng)肽受體結(jié)合,產(chǎn)生細(xì)胞內(nèi)的級聯(lián)反應(yīng)[8-11]。這些細(xì)胞內(nèi)的信號機(jī)制可以通過多巴胺和谷氨酸神經(jīng)遞質(zhì)的刺激而激活[12-13]。當(dāng)成癮藥物刺激后,多巴胺增多,谷氨酸的N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受體顯著上調(diào)[2],這就意味著成癮藥物通過對這些遞質(zhì)的作用可能會激活BDNF的通路,從而激活下游級聯(lián)反應(yīng)。Rack1具有7個(gè)W40結(jié)構(gòu)域,能夠結(jié)合SH2結(jié)構(gòu)域和Fyn[14-15]。有研究表明,當(dāng)cAMP/PKA信號通路的激活導(dǎo)致Rack1從NR2B和Fyn上解離并釋放出來時(shí),在體外培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元細(xì)胞中,大量釋放出的Rack1入核,這些進(jìn)入核內(nèi)的Rack1反過來調(diào)節(jié)BDNF的表達(dá)[16]。

通過條件性位置偏愛實(shí)驗(yàn),我們發(fā)現(xiàn)給藥組小鼠在白箱停留時(shí)間明顯長于生理鹽水組,這說明小鼠通過訓(xùn)練對白箱給藥行為產(chǎn)生了記憶。與對照組相比,嗎啡組小鼠海馬區(qū)的BDNF的mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)水平都有明顯的升高,但是在Rack 1干擾質(zhì)粒的作用下,卻都有明顯的下降,說明在嗎啡作用后,激活了BDNF的通路,從而使cAMP/PKA信號通路激活,Rack 1從NR2B和Fyn上解離并釋放出來,進(jìn)而反過來調(diào)節(jié)了BDNF的表達(dá)。藥物依賴是一個(gè)復(fù)雜的神經(jīng)過程,涉及了各種神經(jīng)遞質(zhì)以及不同的腦區(qū),而Rack1在其他腦區(qū)的作用還值得我們進(jìn)一步的研究。

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