內(nèi)毒素對(duì)大鼠肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞的損傷作用

楊華 侯勇 唐云安

(四川中醫(yī)藥高等?？茖W(xué)?；A(chǔ)部生理教研室,四川 綿陽(yáng) 621000)

急性肺損傷(Acute lung injury,ALI)是嚴(yán)重的休克、感染、創(chuàng)傷和中毒等多種因素所導(dǎo)致的急性彌漫性肺泡和肺血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷,嚴(yán)重階段即為急性呼吸窘迫綜合征(Acute respiratory distress syndrome,ARDS),死亡率高達(dá)40～60%。肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞(Alveolar type II cell,AT-II)損傷是其發(fā)病過(guò)程中的重要環(huán)節(jié)之一。AT-Ⅱ是肺泡表面一類重要的細(xì)胞群體,合成和分泌肺表面活性物質(zhì),補(bǔ)充和分化肺泡Ⅰ型上皮細(xì)胞,修復(fù)肺泡上皮、肺水轉(zhuǎn)運(yùn)、局部免疫等多種重要生理功能,對(duì)維持肺泡結(jié)構(gòu)和功能有重要意義[1]。該細(xì)胞損傷是ALI發(fā)病過(guò)程中的重要環(huán)節(jié)之一。脂多糖(LPS)是內(nèi)毒素的主要生物活性成分,具有極強(qiáng)的生物活性,肺是內(nèi)毒素的主要靶器官之一?，F(xiàn)已明確革蘭陰性菌感染、內(nèi)毒素血癥是ALI主要致病原因之一,但是LPS是否對(duì)AT-Ⅱ有損傷作用還存在較大爭(zhēng)議,我們擬通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)LPS對(duì)AT-Ⅱ的損傷作用,從而進(jìn)一步揭示ALI的發(fā)病機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 材料 成年SD大鼠 18只,200～250g,雌雄各半,由四川大學(xué)華西醫(yī)學(xué)中心實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK(川)2005001;LPS(Sigma);堿性磷酸酶(AKP),乳酸脫氫酶(LDH),丙二醛(MDA)試劑盒(南京建成生物工程研究所);磷標(biāo)準(zhǔn)溶液由四川大學(xué)華西醫(yī)學(xué)中心預(yù)防系營(yíng)養(yǎng)與食品衛(wèi)生學(xué)教研室提供;7252C型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(上海第三分析儀器廠生產(chǎn))。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物模型 18只SD大鼠隨機(jī)分為2組：對(duì)照組以及LPS模型組(n=9),分別經(jīng)頸外靜脈導(dǎo)管注入等容積生理鹽水以及LPS 2 mg?kg-1復(fù)制大鼠急性肺損傷模型。

1.2.2 手術(shù)及標(biāo)本采集 大鼠腹腔注射200g?L-1烏拉坦5mL?kg-1麻醉后固定于鼠板,沿頸部正中切開(kāi)皮膚,分離一側(cè)頸外靜脈,插入導(dǎo)管給藥。給藥后4h行頸椎脫臼處死并行氣管插管術(shù),以4℃生理鹽水20ml?kg-1進(jìn)行支氣管肺泡灌洗,連續(xù)3次,取第1次灌洗所得肺泡灌洗液(BALF)0.2ml用于表面張力的測(cè)量;收集所有BALF并記錄BALF回收量達(dá)到90%,1000 r?min-1離心 10min,取上清1.4ml用于測(cè)AKP、MDA、LDH和總蛋白(TP)等,剩余上清用于磷脂的提取。

1.2.3 肺組織的光鏡觀察 取右肺下葉,以40ml?L-1甲醛固定,石蠟包埋切片,HE染色,光學(xué)顯微鏡觀察。

1.2.4 BA LF中 AKP、MDA、LDH和 TP的測(cè)定 根據(jù)試劑盒說(shuō)明采用放免法測(cè)定BALF中AKP、MDA和LDH的含量,采用考馬斯亮藍(lán)G2250染色法測(cè)定TP含量。

1.2.5 總磷脂(TPL)的測(cè)定 采用Bartlett法[4]略有改進(jìn)。BALF中加入2倍體積的氯仿-甲醇(2∶1,V/V)萃取液,震蕩1min,2500 r?min-1離心 10min,棄上層液體但不棄界面雜質(zhì),加入1/4體積的甲醇-水(1∶1,V/V)萃取液,震蕩 1min,2500 r?min-1離心10min,棄去上層液及界面雜質(zhì),氮?dú)獯蹈?-20℃保存待測(cè)。將TPL加入1ml高氯酸加熱,溫度由低到高逐漸上升,直至顏色由黑變白后繼續(xù)加熱蒸干。磷鉬藍(lán)比色法測(cè)定樣本中無(wú)機(jī)磷含量,根據(jù)磷脂中磷含量約為4%算出磷脂含量,再計(jì)算出每公斤體質(zhì)量的磷脂含量。

1.2.6 表面張力的測(cè)定 用毛細(xì)管法測(cè)定肺泡BALF表面相對(duì)張力,然后根據(jù)拉普拉斯方程σ=rρ g(h+r/3)/2計(jì)算出BALF的表面張力,以此來(lái)反映PS的含量及功能。其中,σ為表面張力(單位為N?cm-1),r為毛細(xì)管的半徑,ρ為液體密度,g為重力加速度,h為液體上升高度。

2 結(jié)果

2.1 LPS對(duì)肺組織的損傷作用

LPS可升高BALF中TP含量、MDA含量以及LDH活性(見(jiàn)表1)。光鏡下可見(jiàn)LPS組大鼠肺間質(zhì)較對(duì)照組明顯增寬,有白細(xì)胞浸潤(rùn),肺泡萎陷、肺不張,肺泡腔偶見(jiàn)紅細(xì)胞,表現(xiàn)為間質(zhì)性肺水腫(圖1)。

表1 脂多糖對(duì)肺組織及肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞的損傷作用(±s,n=9)

表1 脂多糖對(duì)肺組織及肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞的損傷作用(±s,n=9)

＊模型組與對(duì)照組比較P＜0.05;＊＊模型組與對(duì)照組比較P＜0.01。

組別 對(duì)照組 模型組LDH(ukat?L-1) 4.7±1.9 8.2±1.9＊TP(g?L-1) 29±16 85±31＊＊MDA(μ mol?L-1) 1.3±0.3 2.1±0.8＊AKP(nkat?L-1) 102±81 256±101＊＊表面張力(mN?m-1) 19.60±2.5 23.12±2.8＊TPL(μ g?kg-1) 432±43 370±57＊

2.2 LPS對(duì)AT-Ⅱ的損傷作用 LPS可使BALF中AKP活性升高近4倍,使BALF中TPL含量明顯下降,表面張力明顯升高(表1)。

圖1 大鼠肺組織的病理改變

3 討論

革蘭氏陰性菌感染、內(nèi)毒素血癥是引發(fā)急性肺損傷/急性呼吸窘迫綜合征的常見(jiàn)原因。正常生理情況下,AT-II主要分泌大量的肺表面活性物質(zhì)參與肺組織成熟和肺的正常生理功能,其損傷是ALI/ARDS發(fā)病過(guò)程中的重要環(huán)節(jié)之一。ALI時(shí)LPS是否對(duì)AT-Ⅱ有損傷作用還存在較大爭(zhēng)議。本研究發(fā)現(xiàn),頸外靜脈注射LPS后大鼠肺組織出現(xiàn)明顯肺損傷病理形態(tài)變化,LPS可使BALF中TP含量升高,表明肺泡滲出增加;LDH是胞內(nèi)酶,LPS組BALF中LDH活性增加表明細(xì)胞損傷加重;LPS組BALF中MDA含量升高,提示脂質(zhì)過(guò)氧化作用增強(qiáng)。上述4項(xiàng)指標(biāo)變化符合急性肺損傷表現(xiàn),表明LPS性急性肺損傷模型復(fù)制成功。AKP是A T-Ⅱ的特異性分化標(biāo)志,當(dāng)AT-Ⅱ損傷時(shí)被釋放入BALF,LPS使BALF中AKP活性增強(qiáng),表明其對(duì)AT-Ⅱ有損傷作用;磷脂是PS的主要成分,TPL能反映PS含量變化,我們利用定磷法測(cè)量BALF中TPL含量,結(jié)果表明LPS可使BALF中TPL含量降低;表面張力反映了PS降低肺泡表面張力的功能,是AT-Ⅱ合成、分泌PS的質(zhì)和量的綜合體現(xiàn)。綜合TPL及表面張力的變化,表明LPS可以抑制PS的合成、分泌,其機(jī)制可能為內(nèi)毒素血癥時(shí)肺血流阻力增加,肺組織缺血、缺氧,引起 AT-Ⅱ損傷,進(jìn)而影響PS的合成、分泌;也可能是LPS對(duì)AT-Ⅱ有直接損傷作用[2],進(jìn)而使PS合成和分泌減少,具體作用機(jī)制尚有待于進(jìn)一步研究。另外LPS導(dǎo)致AT-II損傷后可能還會(huì)引起合成肺表面活性物質(zhì)蛋白(Surfactant protein,SP)能力下降[3],也有待進(jìn)一步研究。

1 Adamson IY,Young L.Alveolar typeⅡcell growth on pulmonaryendothelial ex tracellular matrix[J].Am J Physiol,1996,270(6 Pt 1)：1017-1022.

2 許峰,何勇,匡鳳梧,等.急性肺損傷大鼠肺表面活性物質(zhì)及肺表面活性物質(zhì)蛋白的研究[J].重慶醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2004,29(2)：131-133.

3 劉靜,王正暉,何立英,等.急性肺損傷對(duì)大鼠肺表面活性物質(zhì)蛋白C合成的影響[J].中國(guó)急救復(fù)蘇與災(zāi)害醫(yī)學(xué)雜志,2008,3(2)：79-81.