熟地黃對(duì)弗氏佐劑誘導(dǎo)大鼠足趾炎癥的影響

王雪燕,溫學(xué)森,張 迪,孔曉妮,史 敏

(山東大學(xué) 藥學(xué)院 生藥學(xué)研究所,山東 濟(jì)南 250012)

熟地黃(Radix Rehmanniae Praeparata)是一種常用中藥材,具有滋陰、補(bǔ)腎和補(bǔ)血活性。中醫(yī)認(rèn)為“久病及腎”,因此,熟地黃多用于慢性疾病的治療。類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎屬于慢性疑難疾病,中醫(yī)將其列入“痹癥”范疇,而西醫(yī)認(rèn)為其屬于自身免疫性疾病。其病因與發(fā)病機(jī)理比較復(fù)雜,西醫(yī)臨床上多以糖皮質(zhì)激素作為一線治療藥物,中醫(yī)則通常辨證用藥,注重標(biāo)本兼治。

熟地黃常出現(xiàn)在治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的方劑中[1]。臨床觀察表明以熟地黃為君藥的六味地黃湯對(duì)于類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎具有輔助治療作用[2-3]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明六味地黃湯對(duì)佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠的免疫系統(tǒng)具有調(diào)節(jié)作用[4-5],但其中熟地黃的作用尚不明確。本文用購自Sigma公司的完全弗氏佐劑(Complete Freund′s Adjuvant,CFA)誘發(fā)大鼠足趾炎癥,以觀察熟地黃對(duì)該模型是否具有抗炎作用。

1 材 料

健康雄性Wistar大鼠,體重160～200 g,由山東大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,許可證號(hào):SCXK(魯)20030004。

醋酸地塞米松片(0.75 mg/片),山東魯抗辰欣藥業(yè)有限公司,批號(hào):080523204;CFA,Sigma公司,批號(hào):068K8729。

熟地黃(購自濟(jì)南建聯(lián)中藥飲片有限公司)加5倍量水,微沸1 h,取煎液,殘?jiān)偌逯?次,每次加3倍量水,微沸1 h,合并3次煎液,濃縮至每1 mL含原生藥0.2 g,分裝,-20℃冷凍備用。

2 方 法

2.1 動(dòng)物分組及給藥

大鼠48只隨機(jī)分為6組:正常對(duì)照組,模型組,低、中、高劑量熟地黃給藥組和陽性藥物組。

引進(jìn)大鼠后,于實(shí)驗(yàn)室適應(yīng)1周,溫度(22±2)℃,相對(duì)濕度(50±5)%,光照12 h。正常對(duì)照組于大鼠右后足墊皮內(nèi)注射生理鹽水100 μ L,其余各組大鼠注射 CFA 100 μ L。造模后第 19天,熟地黃低、中、高劑量組每天灌胃熟地黃水煎液(5 mL/kg),相當(dāng)于熟地黃生藥0.625,1.250,2.500 g/(kg?體重),正常對(duì)照組和模型組灌胃等體積蒸餾水,陽性藥物組給醋酸地塞米松0.5 mg/(kg?體重),連續(xù)給藥10 d。

第19,22,25和28天稱量體重,容積法測(cè)量右后足趾體積(踝關(guān)節(jié)以下)。第29天腹腔注射3%戊巴比妥鈉麻醉,下腔靜脈取血,進(jìn)行紅細(xì)胞(RBC)、白細(xì)胞(WBC)和血小板(PLT)計(jì)數(shù),測(cè)定血紅蛋白含量(HGB)。分離血清,于齊魯醫(yī)院生化室檢測(cè)丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、堿性磷酸酶(AKP)、總蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、球蛋白(GLB)、葡萄糖(Glu)、肌酐(Cr)、游離血紅蛋白(TCH)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白(HDL)和低密度脂蛋白(LDL)含量。取胸腺和脾臟稱重,計(jì)算臟器指數(shù)。切取足掌肉墊,福爾馬林固定,乙醇梯度脫水,正丁醇透蠟,常規(guī)切片,HE染色觀察。

2.2 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

3 結(jié) 果

3.1 熟地黃對(duì)注射CFA大鼠體重的影響

各組大鼠體重變化如表1?？梢?第19天各組體重?zé)o顯著差異。其后,正常對(duì)照組體重增加有所變緩,第25天后又恢復(fù),但與第19天的體重相比,差異均未達(dá)顯著水平。模型組第25和28天與第19天相比,體重顯著增加。熟地黃低、中、高劑量組體重有增加趨勢(shì),但與第19天相比差異不顯著,其中高劑量組體重增加較少,并于第25和28天顯著低于模型組。陽性藥物組大鼠體重第19天以后持續(xù)下降,與正常對(duì)照組和模型組相比,第22,25和28天體重均顯著低下。

3.2 熟地黃對(duì)注射CFA大鼠足趾體積的影響

注射CFA后,大鼠足趾持續(xù)腫脹。給予地塞米松后,足趾體積顯著減小,第25和28天與模型組相比,差異達(dá)極顯著水平,如表2。熟地黃各給藥組未顯示明顯的抗炎作用。

3.3 熟地黃對(duì)CFA大鼠免疫器官和血液參數(shù)的影響

CFA造模導(dǎo)致大鼠脾臟和胸腺指數(shù)顯著下降,地塞米松導(dǎo)致胸腺指數(shù)進(jìn)一步降低。低劑量熟地黃使脾臟指數(shù)得以恢復(fù),隨劑量增加脾臟指數(shù)逐漸下降。低和高劑量熟地黃組大鼠胸腺指數(shù)恢復(fù)到正常水平。

CFA造模組大鼠,除PLT顯著下降外,其它血液指標(biāo)與正常對(duì)照組相比,差異不顯著。地塞米松可使 PLT 進(jìn)一步減少 ,RBC、HGB 、WBC 、ALT、Glu、TCH和TG顯著增高(如表 3～4),而對(duì)AST、AKP、TP、ALB、GLB、HDL和 LDL含量無顯著影響(數(shù)據(jù)未給出)。熟地黃可使血清肌酐含量劑量依賴性增加,高劑量時(shí)與模型組相比差異達(dá)顯著水平。

3.4 足趾肉墊切片

經(jīng)切片(圖1)可見,正常對(duì)照組足趾肉墊無炎癥細(xì)胞浸潤,而模型組可見大量淋巴細(xì)胞浸潤。地塞米松可大幅度降低淋巴細(xì)胞浸潤的程度,而熟地黃各劑量組均無明顯影響。

4 討 論

本研究中熟地黃給藥劑量是依藥典和常用臨床處方為依據(jù)。藥典規(guī)定熟地黃用藥劑量為9～15 g,70 kg人與200g大鼠的體表面積折算系數(shù)為0.018,因此折算出大鼠劑量為0.81～1.35 g/kg。我們選用1.25g/Kg作為中劑量,在此基礎(chǔ)上減1倍和加1倍分別作為低和高劑量。常用臨床處方一般用藥量較大,熟地黃一般處方劑量為24 g,折算成大鼠劑量為2.16 g/kg,接近本研究的高劑量。

表1 熟地黃對(duì)注射CFA大鼠體重的影響(,n=8)Tab.1 Influence of RRP on body weight of CFA-induced rats(,n=8)

表1 熟地黃對(duì)注射CFA大鼠體重的影響(,n=8)Tab.1 Influence of RRP on body weight of CFA-induced rats(,n=8)

與同一天正常對(duì)照組相比:1P＜0.05,2P＜0.01;與模型組相比:3P＜0.05,4P＜0.01;與組內(nèi)19 d相比:5P＜0.05,6P＜0.01 1P＜0.05,2P＜0.01 vs control group;3P＜0.05,4P＜0.01 vs model group of that day;5P＜0.05,6P＜0.01 vs the 19th day in group

組別不同時(shí)間體重/g 19 d 22 d 25 d 28 d正常對(duì)照組 293.4±22.1 304.4±23.3 302.4±26.6 312.9±26.3模型組 296.0±15.7 307.9±14.5 321.6±19.25 325.3±13.76低劑量組 294.1±28.0 302.4±29.0 309.6±33.9 317.3±35.8中劑量組 288.3±28.1 295.6±28.7 310.1±30.2 317.0±29.5高劑量組 293.0±18.3 299.0±20.0 298.6±22.53 303.5±23.63陽性藥物組 299.6±20.1 273.8±23.11,4,5 246.3±18.82,4,5 222.8±19.12,4,6

表2 熟地黃對(duì)注射CFA大鼠足趾體積的影響(,n=8)Tab.2 Influence of RRP on foot volume of CFA-induced rats(,n=8)

表2 熟地黃對(duì)注射CFA大鼠足趾體積的影響(,n=8)Tab.2 Influence of RRP on foot volume of CFA-induced rats(,n=8)

與同一天模型組相比:1P＜0.01;與組內(nèi)19 d相比:2P＜0.01 1P＜0.01 vs model group of that day;2P＜0.01 vs the 19th day in group

組別 致炎后不同時(shí)間足趾體積/mL 19 d 22 d 25 d 28 d正常對(duì)照組 0.76±0.081 0.78±0.061 0.76±0.091 0.78±0.061模型組 1.21±0.15 1.11±0.18 1.12±0.12 1.13±0.13低劑量組 1.24±0.11 1.21±0.10 1.25±0.10 1.27±0.14中劑量組 1.15±0.14 1.13±0.08 1.16±0.16 1.12±0.06高劑量組 1.16±0.14 1.19±0.10 1.18±0.12 1.10±0.10陽性藥物組 1.15±0.09 1.00±0.102 0.91±0.091,2 0.93±0.071,2

表3 熟地黃對(duì)注射CFA大鼠免疫器官、血紅蛋白和血細(xì)胞計(jì)數(shù)的影響( ±s,n=8)Tab.3 Influence of RRP on immune organ,hemoglobin and blood cell counts in CFA-induced rats( ±s,n=8)

表3 熟地黃對(duì)注射CFA大鼠免疫器官、血紅蛋白和血細(xì)胞計(jì)數(shù)的影響( ±s,n=8)Tab.3 Influence of RRP on immune organ,hemoglobin and blood cell counts in CFA-induced rats( ±s,n=8)

與正常對(duì)照組比較:1P＜0.05,2P＜0.01;與模型組比較:3P＜0.05,4P＜0.01 1P＜0.05,2P＜0.01 vs control group;3P＜0.05,4P＜0.01 vs model group

組別 脾臟指數(shù) 胸腺指數(shù)RBCHGBWBCPLT/[g/(kg?體重)]/[g/(kg?體重)]/(1012/L)/(g/L)/(109/L)/(109/L)正常對(duì)照組 2.46±0.21 1.36±0.12 7.68±0.32 146.5±9.3 7.20±2.25 980.8±108.0模型組 1.97±0.082 1.08±0.042 7.74±0.45 147.5±12.6 6.98±1.17 866.1±53.11低劑量組 2.40±0.274 1.30±0.154 7.36±0.38 141.0±9.9 7.46±1.45 839.3±119.4中劑量組 2.27±0.223 1.14±0.111 7.70±0.48 153.5±9.6 8.84±1.36 851.1±117.6高劑量組 2.11±0.181 1.35±0.114 7.95±0.56 153.1±9.4 8.77±2.78 933.4±83.93陽性藥物組 1.98±0.182 0.14±0.012,4 8.54±0.563 162.3±14.1310.30±3.673 560.7±120.54

表4 熟地黃對(duì)注射CFA大鼠血清ALT、Glu、Cr、TCH和TG含量的影響( ±s,n=8)Tab.4 Influence of RRQ on the content of ALT,Glu,Cr,TCH and TG in CFA-induced rats( ±s,n=8)

表4 熟地黃對(duì)注射CFA大鼠血清ALT、Glu、Cr、TCH和TG含量的影響( ±s,n=8)Tab.4 Influence of RRQ on the content of ALT,Glu,Cr,TCH and TG in CFA-induced rats( ±s,n=8)

與模型組比較:1P＜0.05,2P＜0.01 1P＜0.05,2P＜0.01 vs model group

組別 ALT/(u/L) Glu/(mmol/L) Cr/(μ mol/L) TCH/(mmol/L) TG/(mmol/L)正常對(duì)照組 43.4±6.0 4.980±1.010 51.70±4.34 1.280±0.123 0.716±0.305模型組 41.9±5.0 5.120±1.076 47.45±7.59 1.260±0.217 0.755±0.446低劑量組 46.0±5.7 8.357±0.4332 50.29±4.11 1.096±0.184 0.739±0.224中劑量組 58.9±13.52 5.569±1.279 53.48±4.60 1.258±0.160 0.723±0.236高劑量組 48.0±7.3 6.207±1.517 61.17±10.651 1.175±0.125 0.510±0.049陽性藥物組 96.6±10.52 7.689±1.1182 47.57±2.70 2.029±0.5642 1.641±0.6822

圖1 大鼠足趾肉墊切片,HE(×40)Fig.1 The cross section of rat paw,HE(×40)

用于復(fù)制大鼠佐劑性關(guān)節(jié)炎的CFA通常每1 mL含有滅活結(jié)核分枝桿菌或卡介苗10 mg作為抗原,需自行配制。材料來源和制備技術(shù)顯著影響實(shí)驗(yàn)的成功率。近年來,滅活結(jié)核分枝桿菌或卡介苗均難以購買,影響了該模型的應(yīng)用。本研究采用Sigma公司的CFA,但其分枝桿菌含量為1 mg/mL。Kumar和Roy曾用該產(chǎn)品誘導(dǎo)大鼠單側(cè)關(guān)節(jié)炎[6]。

Mythilypriya等[7]制備的佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠存在多種血液指標(biāo)異常,本文選擇其報(bào)道有顯著差異的16個(gè)指標(biāo)進(jìn)行了檢測(cè),發(fā)現(xiàn)模型組僅有PLT顯著減少,而非增加,其他指標(biāo)未見顯著變化。一般認(rèn)為佐劑性關(guān)節(jié)炎是一種遲發(fā)性超敏反應(yīng),以淋巴細(xì)胞活化為主[8]。雖然本文切片也見大量淋巴細(xì)胞浸潤,但實(shí)驗(yàn)期間未見繼發(fā)病變和體重下降。因此,用Sigma公司的CFA誘導(dǎo)的大鼠足趾炎癥與文獻(xiàn)報(bào)道的佐劑性關(guān)節(jié)炎尚有較大差距,抗原劑量不足可能是主要原因。不過本文用該產(chǎn)品誘導(dǎo)的大鼠足趾腫脹可保持4周以上,其應(yīng)屬于慢性炎癥。

地塞米松可顯著減輕CFA誘導(dǎo)的大鼠足趾腫脹,說明該模型對(duì)糖皮質(zhì)激素敏感。不過地塞米松同時(shí)導(dǎo)致多種毒副作用,如胸腺萎縮,RBC、WBC、HGB、ALT、Glu、TCH 和TG 顯著升高,PLT顯著下降。給予地塞米松后,大鼠體重顯著降低,與文獻(xiàn)報(bào)道[9-10]一致,可能與其糖異生作用有關(guān),其使蛋白質(zhì)、脂肪等分解轉(zhuǎn)化為葡萄糖,致使體重下降,血糖增高。

盡管臨床上熟地黃可用于多種慢性炎癥的治療,并認(rèn)為其具有糖皮質(zhì)激素樣作用[11],但本文發(fā)現(xiàn)熟地黃對(duì)該炎癥模型無消炎作用,說明熟地黃的作用機(jī)制不同于糖皮質(zhì)激素。在某些方面熟地黃的影響與地塞米松相反,如胸腺指數(shù)和血小板計(jì)數(shù)等,這提示臨床上用糖皮質(zhì)激素治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等慢性炎癥時(shí),熟地黃或含熟地黃的方劑可用于減輕其毒副作用[2-5]。

總之,Sigma公司的CFA確實(shí)可以誘導(dǎo)大鼠足趾長期腫脹,腫脹部位有大量淋巴細(xì)胞浸潤,該炎癥對(duì)地塞米松敏感,而熟地黃影響不顯著,提示二者的作用機(jī)制不同。熟地黃在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎治療中可能主要起輔助作用,如緩解患者的腎陰虛癥狀等。

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