纖維素降解菌群篩選與降解活性分析

吳勝蓮，汪 彬，周映華，吳迎奔，尹紅梅

（湖南省微生物研究所，長沙 410009）

纖維素是自然界中分布最廣、儲量最豐富的一類可再生資源，占植物干質(zhì)量的35%～50%，全球每年可產(chǎn)纖維素類干物質(zhì)達(dá)1012t以上[1-2]。纖維素的分解利用對于解決未來的能源危機(jī)與環(huán)境問題意義重大，因此如何更有效地開發(fā)和利用纖維素資源已成為當(dāng)今世界的熱門課題之一。至今，已有很多關(guān)于人工培養(yǎng)純化纖維素降解菌的報道，其中大部分是以純培養(yǎng)方法進(jìn)行分離和篩選[3-6]。有研究表明，微生物菌落中不同菌種之間存在協(xié)同作用，且各菌種對環(huán)境要求苛刻，自然界中的微生物大部分都無法在實(shí)驗室進(jìn)行分離培養(yǎng)，常規(guī)的分離培養(yǎng)方法往往只能得到很少的一部分信息。因此，在環(huán)境的纖維素分解研究上，復(fù)合菌的作用逐漸得到重視。史玉英等分離篩選了纖維素分解菌群，證實(shí)了復(fù)合菌分解活性顯著高于單一菌種[7]。崔宗均等以4種高溫堆肥的產(chǎn)物為原料構(gòu)建了1組高效穩(wěn)定的纖維素分解復(fù)合菌群，把自然界中多種微生物協(xié)同降解纖維素的過程再現(xiàn)于人工培養(yǎng)條件下[8]。

本文從富含腐殖質(zhì)的土壤（造紙廠原料堆放處和排污口污泥）篩選了9組能穩(wěn)定高效分解纖維素的復(fù)合菌群，并對這9組復(fù)合菌群做了最適溫度和最適pH的單因素試驗，將這9組復(fù)合菌群在其最適溫度和pH下培養(yǎng)3 d，分別于24、48、72 h測定其羧甲基纖維素（CMC）酶活性。

1 材料與方法

1.1 培養(yǎng)條件

蛋白胨纖維素培養(yǎng)基（PCS）成分：蛋白胨、酵母膏、NaCl和纖維素（濾紙條）各 5 g·L－1，CaCO32 g·L－1，K2HPO4、MgSO4各 0.5 g·L－1，微量元素溶液0.5 mL·L－1，50℃靜置培養(yǎng)，使其處于溶解氧為0.02～0.40 的微氧環(huán)境；微量元素液成分（g·L－1）：ZnSO40.30，CaCl20.25，CuSO40.25，F(xiàn)eSO40.20。

1.2 復(fù)合菌群的篩選

從富含腐殖質(zhì)的土壤中取樣，在1.5×15.0 cm的試管內(nèi)裝10 mL PCS培養(yǎng)基，以濾紙條作為碳源，50℃靜止培養(yǎng)。當(dāng)試管內(nèi)濾紙條開始降解時，搖勻，取1 mL培養(yǎng)液作為種子接到新鮮PCS培養(yǎng)基中。如此一直傳代培養(yǎng)，淘汰失去分解能力的菌群，留下分解能力強(qiáng)的菌群。

1.3 培養(yǎng)溫度對復(fù)合菌群降解濾紙纖維素的影響

將篩選出的9組復(fù)合菌群的培養(yǎng)溫度分別在40、50、60℃，自然pH，靜置培養(yǎng)，觀察試管中濾紙條的降解情況。

1.4 初始pH對復(fù)合菌群降解濾紙纖維素的影響

將篩選出的9組復(fù)合菌群在pH分別為6、7、8時，采用1.3中篩選出的最適培養(yǎng)濃度靜止培養(yǎng)，觀察試管中濾紙條的降解情況。

1.5 9組復(fù)合菌群分解濾紙纖維素活性的測定

將9組復(fù)合菌群在1.3和1.4中篩選出的最適溫度和最適初始 pH下培養(yǎng)3 d，分別于24、48、72 h測定CMC酶活性。

纖維素粗酶液的制備：將9組復(fù)合菌群在各自的最適溫度和最適的初始 pH下培養(yǎng)3 d，分別于24、48、72 h取培養(yǎng)液，3 000 rpm離心15 min，上清液即為粗酶液。

底物溶液：準(zhǔn)確配制0.625%羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）磷酸鈉緩沖液（0.2 mol·L－1，pH 7.0）加熱攪拌使之溶解。

3,5-二硝基水楊酸（DNS）顯色劑：稱取10 g 3,5-二硝基水楊酸溶于蒸餾水中，加入 20 g氫氧化鈉、200 g酒石酸鉀鈉和500 mL水，加熱溶解后加入重蒸酚2 g、無水亞硫酸鈉0.5 g，全部溶解后冷卻，定容至1 000 mL，貯于棕色瓶中，常溫放置1周后過濾使用。

葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線制備：分別取1 mg·mL－1葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液 0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL，依次加入7支25 mL的比色試管中，以蒸餾水定容至 2.0 mL，再加入DNS試劑1.5 mL，在沸水中煮沸 5 min，流水冷卻，加蒸餾水21.5 mL，搖勻，在540 nm處進(jìn)行比色，用空白管溶液調(diào)零點(diǎn)，記錄吸光度值，以葡萄糖濃度為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

纖維素酶活性測定：取3支20 mL刻度試管，2支作為平行樣品，1支作為空白對照。樣品管各加1 mL粗酶液及4 mL預(yù)熱至50℃的底物溶液，置50℃水浴，10 min取出，每個管立即分別加入2 mol·L－1氫氧化鈉溶液1 mL和DNS顯色液2 mL，搖勻后對照試管中加入粗酶液1 mL。將3支試管放入沸水中煮沸5 min，立即冷卻，用蒸餾水定容至20 mL，用UV 2000型分光光度儀于 490 nm處測OD值。從標(biāo)準(zhǔn)曲線中計算產(chǎn)生的葡萄糖量，以每毫升粗酶液反應(yīng) 1 min釋放1μg葡萄糖的量為1個酶活力單位（U）。

2 結(jié)果與分析

2.1 篩選和馴化

經(jīng)過30代以上的繼代培養(yǎng)得到了9組對纖維素具有較高分解能力且穩(wěn)定的復(fù)合菌群（S1、S2、S3、S4、S5、S6、S7、S8、S9），結(jié)果見表 1。其中從原料堆放處篩選得到的復(fù)合菌群分解纖維素的效果最好。經(jīng)過30代以上的繼代培養(yǎng)，9組復(fù)合菌群降解纖維素的速度均得到了明顯的提高，全部提高到2或2.5 d?？赡苁窃诓粩嗟膫鞔^程中，不能以纖維素為碳源的微生物不斷減少，而纖維素降解菌不斷增多，且各菌種之間的協(xié)同作用不斷增強(qiáng)，這與崔宗均試驗結(jié)果相一致[8]。

表1 9種培養(yǎng)物的分解速度d

2.2 培養(yǎng)溫度對復(fù)合菌群降解濾紙纖維素的影響

培養(yǎng)溫度對復(fù)合菌群降解濾紙纖維素的影響見表2。

表2 培養(yǎng)溫度對復(fù)合菌群降解纖維素的影響d

通過觀察9組復(fù)合菌在7 d里對濾紙條的降解情況，可以看出在50、60℃時復(fù)合菌群降解濾紙的速度明顯快于40℃。其中 S1、S2、S4、S6、S85組復(fù)合菌群在50℃對濾紙降解速度最快；S5在60℃對濾紙降解速度最快；S3、S7、S9在50、60℃對濾紙的降解速度幾乎相同。由此可見，這9組菌都適應(yīng)于中高溫的堆肥環(huán)境。

2.3 初始pH對復(fù)合菌群降解濾紙纖維素的影響

復(fù)合菌群在初始pH不同時對濾紙條的降解情況見表3。由表3可以看出，除S2在初始pH為8時對濾紙纖維素沒有表現(xiàn)出降解活性以外，其余8組復(fù)合菌群在初始pH為6、7、8時，均表現(xiàn)出了對濾紙纖維素的降解活性。其中，S8、S9在pH為6、7、8時將濾紙完全降解均只需 2 d，說明 S8、S9對酸堿度具有一定耐受性；而 S1、S6、S7則最適合中性偏酸的環(huán)境；S2、S3、S4、S54組菌群都較適合pH為7的中性環(huán)境。

表3 初始pH對復(fù)合菌群降解纖維素的影響d

2.4 復(fù)合菌群對濾紙纖維素的分解活性

復(fù)合菌群對濾紙纖維素的分解活性見圖1。從圖1可以看出，測得最高的3個CMC酶活性分別出現(xiàn)在 S1的72 h、S2的 48 h和S6的48 h，其酶活力值分別為 33.1、37.7和34.1 U。各組復(fù)合菌群的最大CMC酶活性有差異，而對于不同復(fù)合菌群來說，最大CMC酶活性出現(xiàn)的時間也不盡相同，其中 S2、S3、S4、S6、S7、S8、S97 組復(fù)合菌群的酶活性最大值均出現(xiàn)在48 h，較樸哲、王偉東等報道的降解性有所提高[9,11]。經(jīng)觀察，一般在48 h剛開始降解，所以這7組復(fù)合菌群的酶活性最高值均出現(xiàn)在纖維素剛開始降解時；而S1和 S5的 CMC酶活性的最大值則出現(xiàn)在72 h，也就是纖維素完全降解的時候。由此可以得出，不同纖維素菌群的CMC酶活性的最大值出現(xiàn)的時間并不一致。

3 結(jié)論與展望

9組復(fù)合菌群均經(jīng)過30代以上的傳代培養(yǎng)，纖維素降解能力強(qiáng)并可以穩(wěn)定遺傳，最適溫度為50～60℃，最適初始pH為6～8，所以這9組菌都適應(yīng)于高溫、微好氧的堆肥環(huán)境，能直接應(yīng)用于農(nóng)業(yè)廢棄有機(jī)物的堆肥處理。

在所做的研究基礎(chǔ)上，本試驗將這9組復(fù)合菌群按照排列組合的方式進(jìn)行了混合培養(yǎng)，以濾紙纖維素作為底物，結(jié)果顯示，所有的組合對纖維素的降解效果都要好于單組菌群對纖維素的降解效果，這為以后獲得更高效的降解纖維素的復(fù)合菌群開辟了更廣闊的道路。

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