理解原理 尋求創(chuàng)新

生物學是一門實驗科學，觀察和實驗是生物科學基本的研究方法。光合作用是高中生物學的重點和難點內容之一。葉綠體是光合作用的場所，做好必修一《分子與細胞》中“綠葉中色素的提取和分離”的實驗，有助于學生理解葉綠體中色素的種類和含量，加深學生對色素作用的理解，進而對光合作用的理解和掌握。

1 理解實驗原理

課程標準要求，學生必須知道每個實驗的實驗原理、實驗程序和每步操作的目的和理論依據(jù)。教材為此設計了一個比較詳細的實驗方案，學生能不能出色地完成此實驗，關鍵在于對實驗原理能否很好地理解。實驗的每個步驟均有其內在的道理，因此說，理解原理不僅是實驗成功的關鍵，也是理解實驗方法步驟的關鍵。若能將實驗原理知識遷移到實驗方法步驟中去，學生就更易理解。如：

①取材時要選取新鮮的、顏色深綠的葉片。目的是使濾液中含有較多的色素。

②由于光合色素位于葉綠體的囊狀結構上。要把它提取出來必須破壞葉表皮、細胞壁和細胞膜、葉綠體的雙層膜，所以要剪碎后加二氧化硅研磨，目的是為了研磨得更加充分，更有效地破壞細胞結構。加入少許碳酸鈣的目的是為了防止在研磨過程中，葉綠素受到破壞。因為葉綠素分子結構中含有一個鎂原子，當細胞破裂時，細胞液內有機酸中的氫可取代鎂原子而成為褐色的去鎂葉綠素，碳酸鈣可中和有機酸以防止去鎂反應的發(fā)生。又因為葉綠體的色素不溶于水，但可溶于有機溶劑中，所以還要加入無水乙醇使色素溶解，從而提取各種色素。

③研磨要迅速、充分。這是因為無水乙醇易揮發(fā)，同時葉綠素極不穩(wěn)定，易被活細胞中的葉綠素酶水解而破壞。

④制備濾紙條時，根據(jù)小孔(邊緣)擴散原理，物貢分子沿邊緣擴散速度要大于里邊擴散的速度，因此要將濾紙條的一端剪去兩角(剪角后底邊寬度接近濾紙條寬度的1/2時為最好)，這樣，可有效防止濾紙條兩側色素擴散過快的現(xiàn)象，而使色素帶平行、整齊，則由于觀察實驗結果。在距去兩角的一端1 cm處用鉛筆畫一條細的橫線，目的是為畫濾液細線提供參照線。畫濾液細線時，待濾液干燥后重復畫1～2次，是為了增加色素的分子數(shù)，以便在濾紙條上分離出4條明顯的色素帶來。如果在不干燥的情況下連續(xù)畫線，色素會隨濾液中的液體在濾紙條上的擴散而擴散，畫出的濾液細線較寬，其分離結果是相鄰的兩條色素帶會發(fā)生部分重疊。

⑤分離的原理與4種色素在層析液中的溶解度有關。層析液是一種脂溶性很強的有機溶劑，由于4種色素的化學組成和結構不同，因此每一種色素分子在層析液中的溶解度不同，因而4種色素隨層析液在濾紙條上的擴散速度就不同，其中胡蘿卜素在層析液中的溶解度最高，擴散速度最快，其次是葉黃素、葉綠素a，葉綠素b溶解度最低，擴散得最慢。依據(jù)此原理使濾紙條上處于同一濾液細線上的4種色素在擴散中分離開來。

⑥將3 mL層析液倒入試管中，將濾紙條(有濾液細線的一端朝下)輕輕插入層析液中，濾紙條斜靠著試管內壁，隨后用棉塞塞緊試管口。注意不能讓濾紙條與沾有層析液的試管內壁緊貼，也不能讓濾液細線觸及層析液，因為色素會溶解于層析液中，導致分離的色素帶不清晰，影響實驗效果。

因此，在實驗時，教師要講清或提出問題讓學生思考，使學生不但知其然，還要知其所以然。在指導學生進行此實驗時，要求學生嚴格按教材要求操作，然而學生們的實驗成功率總是不高，于是筆者同學生一起分析原因，結果發(fā)現(xiàn)教材在實驗取材、提取色素的方法、畫濾液細線、分離色素等方面均有不足。為此，做了一些改進再實驗，取得了顯著的效果。

2 尋求創(chuàng)新方法

2.1 提取綠葉中色素的改進

獲取高濃度的色素提取液是該實驗成功的一個關鍵環(huán)節(jié)。色素提取液的質量高低直接影響到分離效果的好壞乃至整個實驗的成敗。如何提取綠葉中的色素，教材中介紹的做法是：稱取5 g新鮮的綠色葉片(如菠菜葉)剪碎，放入研缽中，向研缽中放入少許二氧化硅和碳酸鈣，再加入10 mL無水乙醇，進行迅速、充分的研磨，然后將研磨液迅速倒入玻璃漏斗(漏斗基部放一塊單層尼龍布)中進行過濾，將濾液收集到試管中，及時用棉塞將試管口塞嚴，供隨后進行的分離色素步驟用。

經(jīng)過多次的實踐，師生覺得教材介紹的方法存在的問題有：

①所用材料過多，每個實驗小組要用5 g菠菜葉。

②所用藥品種數(shù)過多，而且二氧化硅、碳酸鈣的用量又不好把握(二氧化硅是特別細的白色粉末，易過量，使濾液中含有較多的二氧化硅，而導致濾液顏色變淺；難溶于水的碳酸鈣明顯地殘存于濾液中，濾液中雜質多，顏色淺，影響實驗效果)，無水乙醇用量大，一次要用10 mL。

③所用儀器多，操作步驟多，既要研磨，又要過濾，提取濾液所需時間較長。

④進行“迅速、充分的研磨”，研磨到什么程度才叫充分呢?葉片呈細碎片狀，算研磨充分嗎?可是此時提取的濾液顏色淡，色素含量不高，且渾濁，經(jīng)紙層析后分離效果欠佳。

針對以上問題，對綠葉中色素的提取進行了較大的改進：

改“研磨法”使葉肉細胞破裂、使色素溶解在無水乙醇中為“水浴加熱法”，讓葉片中的色素溶解在無水乙醇里，具體實施方法如下：

每個實驗小組稱取1 g綠色葉片，剪碎放入試管底部，用量筒量取1.5～2 mL無水乙醇倒入試管中，將試管置于沸水中水浴加熱1～2 min，使葉片含有的色素溶解在無水乙醇里，當看到試管中的液體呈深綠色時，即可將試管從沸水中取出，冷卻待用。

改進后的方法有以下幾個優(yōu)點：

①取材廣泛。由于省去了研磨這一步驟，一些較難研磨的常見木本植物(如大葉黃楊、樟樹、竹葉、法國梧桐等)、常見的植物(如美人蕉、車前草等)、菜農廢棄的葉片(如佛手瓜、蘿卜、胡蘿卜、甘薯等)也可用做實驗材料(若能在室內預先晾半天，失掉一些水分，效果更好)，只要顏色深綠，效果都很好，使材料來源更加廣泛，可就地取材，減少季節(jié)、氣候等因素對實驗的影響。

②節(jié)約材料。原來需5 g葉片，改進后只需1 g，僅是原來的1／5，能節(jié)約材料。同時用量少更能挑選質量好、老嫩適中的葉片做實驗材料，以提高色素提取液的質量。

③節(jié)約藥品。原來要用10 mL無水乙醇作溶劑，改進后只用1.5-2 mL即可，僅約為原來的1／5。改進后完全不用二氧化硅和碳酸鈣，節(jié)約了大量的藥品。這也符合當今的時代要求(建立資源節(jié)約型社會)。

④節(jié)約時間。原來的操作程序繁瑣，既要研磨，又要過濾，所花時間較長，一般要10 min左右才能得到濾液，使很多學生在一節(jié)課的時間內不能完成整個實驗。改進后只要事先準備沸水，而且可以幾個實驗小組共用一杯沸水。稱取葉片后稍微剪碎，放進試管，加好無水乙醇，將試管放進沸水中水浴約2 min，即可得到理想的色素提取液。取出試管，稍微冷卻，然后將試管中的提取液小心倒入另一支試管中，就可畫濾液細線(也可省去傾倒這一步，用滴管直接在原試管中吸取冷卻的色素提取液)。

⑤實驗效果好。原來提取的濾液，部分學生常因操作不當容易產(chǎn)生失誤，得到的濾液常呈黃綠色，渾濁不清，稍微放置后容易分層，經(jīng)紙層析后，色素分離效果總是欠佳。改進后提取的色素液，墨綠透明，濃度高，畫濾液細線只要畫2-3次，經(jīng)層析分離后，4條色素帶清晰分明。

另外，如果幾個實驗小組共用一套儀器提取綠葉中的色素，則可相應地增加葉片和無水乙醇的用量，用小燒杯盛裝后置于大燒杯中水浴，則可一次制得量較多而又耐用的色素提取液。

2.2 制備濾紙條的改進

教材介紹：將干燥的定性濾紙剪成長和寬略小于試管長和寬的濾紙條。由于濾紙條過長、過寬，其重量過大，在層析過程中濾紙條易變軟下塌，使濾液細線沒入層析液中；另外，多個班級多個實驗小組輪流做實驗時，難保試管壁干燥，則濾紙條易被試管壁水珠沾濕，影響實驗效果。為了找到妥善的解決辦法，教師號召學生大膽探索，經(jīng)過各種對比實驗，學生們得出了如下方法解決這一難題：懸空在試管中或燒杯內，不能讓它碰到壁上，具體操作方法見后面2.4。

本實驗不僅可用條形濾紙進行層析，還可以采用圓形濾紙進行層析。

2.3 畫濾液細線的改進

畫濾液細線是要求很高的一個操作步驟。色素帶分離效果的好壞與濾液細線畫得是否“細、直、齊”直接相關，而教材中介紹的用毛細吸管吸取少量濾液畫細線，因條件限制，實驗室無法拉制毛細吸管，再說此方法也不好操作，學生采用以下2種嘗試方法：

(1)蓋章法。

用滴管吸取一滴濾液滴在一潔凈載玻片的中央，當作“印泥”，用潔凈蓋玻片或塑料膠片的一側作“印章”，沾取濾液，然后對齊濾紙條上的參照線，垂直按下印到濾紙條上，并稱其為“蓋章”，待濾液干后重復2～3次，此法省時省力，且畫的濾液細線較易達到“細、直、齊”。

(2)點樣法。

在濾紙條上畫濾液細線有一定難度，而點色素斑比畫濾液細線則容易得多。將一干燥的的圓形定性濾紙(直徑為11 cm)蓋在培養(yǎng)皿上，在中央用細毛筆點上2。3次色素提取液(點在同一點上)，點成圓形的色素斑。

2.4 分離色素裝置的改進

2.4.1 試管法

針對層析時，濾紙條容易下滑到試管中，改進的作法是：取1枚大頭針，將它的一端折成勾狀，另一端插入試管塞，再用1個回形針掛在勾上，用回形針夾住畫好濾液細線的濾紙條(濾紙條的長度事先量好，不能讓層析液沒及濾液細線)，將3 mL層析液倒入試管中，用試管塞塞緊試管口，進行層析。

2.4.2 燒杯法

因為試管空間小，操作難度還是較大，容易使濾紙條邊緣碰到壁上而沾上層析液從而影響其實驗效果。對此可改為用燒杯層析：此法還可幾個實驗小組共用一份層析液，節(jié)約藥品。事先量好燒杯的高度，再根據(jù)燒杯高度制備濾紙條，讓濾紙條長度長出燒杯1 cm，將長出部分做直角彎折，另一端仍剪去兩角，在距頂端1 cm處畫濾液細線。然后將培養(yǎng)皿的內頂壁涂上膠水，再將濾紙條彎折部分貼于內頂壁，可以將數(shù)條濾紙呈輪狀依次貼妥。向燒杯中注入適量的層析液，加蓋培養(yǎng)皿蓋，這時的濾紙條均垂直懸于培養(yǎng)皿的內頂壁，高度一致，互不粘連，吸層析液后仍保持垂直狀態(tài)。

2.4.3 培養(yǎng)皿法

對點樣法的層析：取一枚縫衣針，穿一條細棉線，在棉線末端打個結，將針從圓形濾紙正面穿過色素斑中心，在距線結約4 cm處剪斷棉線。取直徑10 cm的培養(yǎng)皿一套，向培養(yǎng)皿底中加入5 mL層析液。把上述圓形濾紙扣在培養(yǎng)皿底上面，無線結的一面朝下，棉線則浸沒在層析液中，再將培養(yǎng)皿蓋蓋在濾紙上。采用此方法，可以看到色素隨層析液由線結處向周圍均勻擴散。幾分鐘后，可觀察到4個近似同心圓的大小不一的顏色清晰的色素環(huán)，實驗效果非常顯著。而且層析時，不用擔心濾紙上的色素會沒及到層析液中，不失為一種好方法。

2.5 層析液的改進

教材中給出了兩種層析液配方：①石油醚：丙酮：苯(20：2：1)；②93號汽油。通過查閱資料知道也可用如下配方：③石油醚：丙酮(10：1)；④石油醚：酒精(10：1)；⑤純酒精；⑥純石油醚。這些方法的分離效果也都很好，果真如此嗎?

因此教師有意設計了一個比較實驗，通過師生共同探索、討論，試圖找到一種分離色素的最佳層析液。要求每個實驗小組都用3種層析液進行層析，其中①、②為必做，另外按組別分別做③、④、⑤、⑥中的一種，比較分離色素的效果，結果發(fā)現(xiàn)：

(1)層析液①的分離效果好，且速度快；

(2)層析液②的分離效果欠佳，胡蘿卜素、葉黃素顏色非常淺，且葉綠素a、葉綠素b很難分開：

(3)層析液③的分離效果與①差不多：

(4)層析液④分離出的色素帶中葉綠素a與葉黃素位置發(fā)生了互換：

(5)層析液⑤、⑥雖簡便一些，但分離效果欠佳。

別外，如果考慮到苯對人體有害，則配方③是一種較好的層析液。

2.6 實驗方法的改進

實驗設計很重要的一條原則是對照原則，教師可設計對照實驗，加深學生對本實驗的理解和掌握。

如設立一個空白對照組，在其他條件完全相同的情況下，不畫濾液細線，結果進行對照，消除“不同色帶是層析液在濾紙上擴散后留下的顏色”的懷疑。這樣同時也培養(yǎng)學生嚴謹?shù)膶嶒炞黠L，體現(xiàn)生物學科研的基本原則。

為了強調不要使層析液沒及濾液細線的意義。也可以設立一個沒及濾液細線的對照組，結果發(fā)現(xiàn)色素會被溶解下來，而導致無法分離。

教師還可鼓勵學生通過對比實驗來研究哪種方法能達到最佳的實驗效果。如綠葉與無水乙醇的量的比例作一研究；對濾紙條的畫線次數(shù)的研究等，通過進行對比實驗，得出結論。

經(jīng)過以上改進后，此實驗的成功率大大提高了，學生也終于悟出：不應迷信課本，不能為做實驗而做實驗，而要敢于設想，大膽探索科學的操作方法，多動腦、多動手。其實實驗方案的設計本身就不是唯一的，每個實驗都沒有固定的不可變更的模式。為了得到明顯的實驗現(xiàn)象，達到滿意的實驗效果，師生要不斷鉆研，勇于探索，努力尋求更便捷、效果更好的實驗方法。要是能經(jīng)常這樣嘗試，非常有利于培養(yǎng)學生的實踐能力和創(chuàng)新意識，能全面提高學生的科學素質。