血漿必需氨基酸濃度與細(xì)胞自噬程度相關(guān)性分析

王慧俐, 邱 齡, 李艷芳 (山西醫(yī)科大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院心內(nèi)科, 太原 030001)

細(xì)胞自噬是廣泛存在于真核細(xì)胞中的生命現(xiàn)象,是生物在其發(fā)育、老化過程中都存在的一個凈化自身多余或受損細(xì)胞器的共同機制,這一過程在細(xì)胞清除廢物、結(jié)構(gòu)重建、生長發(fā)育中起重要作用[1]。自噬的消長受多因素的影響,饑餓、胰高血糖素可以誘導(dǎo)自噬;胰島素抑制自噬。他們的作用點在于影響血漿氨基酸的水平,當(dāng)氨基酸水平降低時自噬啟動,相反自噬被抑制[2]。但不同氨基酸對細(xì)胞自噬程度的影響,目前國內(nèi)外相關(guān)文獻(xiàn)較少。本實驗采用定期饑餓大鼠誘導(dǎo)自噬,一定時期后檢測血漿必需氨基酸濃度和肝臟細(xì)胞自噬程度做相關(guān)性分析,以探討哪些血漿必需氨基酸的濃度與細(xì)胞自噬程度相關(guān)性大,為今后誘導(dǎo)或抑制細(xì)胞自噬的研究提供實驗基礎(chǔ),為細(xì)胞自噬在臨床中的應(yīng)用提供實驗依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 儀器和試劑 Agilent 1200高效液相色譜系統(tǒng),包括四元泵、脫氣機、自動進(jìn)樣器、紫外檢測器、柱溫箱,HP化學(xué)工作站;透射式電鏡(日本日立 HITACHI公司 H-600);超薄切片機(瑞典 LKB公司LKB-Ⅴ )。

8種氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品[蘇氨酸 (Thr)、色氨酸(Trp)、異亮氨酸 (Ile)、亮氨酸 (Leu)、纈氨酸(Val)、蛋氨酸 (Met)、苯丙氨酸 (Phe)、賴氨酸(Lys)]購自 Sigma公司;甲醇、乙腈為 HPLC,三乙胺、四氫呋喃、醋酸鈉均為分析純,購自天津市北聯(lián)精細(xì)化學(xué)品開發(fā)有限公司;硼酸、鄰苯二甲醛、巰基乙醇(上海生工生物工程技術(shù)有限公司進(jìn)口分裝);24月齡 SD雌性大鼠,體重 320-470g(山西醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心)。

1.2 方法

1.2.1 大鼠分組及取材 大鼠 30只自由飲食洗脫2周,飼料為全價顆粒料(主要營養(yǎng)成分:粗蛋白19.31%、粗脂肪 2.9%、粗纖維 3.1%、水分 8.7%、鈣 0.5%、磷 0.5%),2周后按體重隨機分為 A組(正常飲食對照組)、B組(1 d自由飲食 1 d禁食)、C組(5 d自由飲食 2 d禁食)3組(每組 10只)。普通環(huán)境飼養(yǎng),飼料同上,溫度 20-24℃,濕度55%-80%,自然光照,飲用自來水,每周換墊料 2次。飼養(yǎng) 5個月后,于 B組和 C組均應(yīng)禁食當(dāng)天清晨取標(biāo)本。25%的烏拉坦麻醉大鼠后暴露肝臟,快速剪下一小塊肝臟組織在預(yù)冷的固定液30 s內(nèi)切成1 mm3大小的組織塊,置于 2%的戊二醛固定液 2 h后緩沖液沖洗后浸泡,4℃保存?zhèn)溆?。垂直心臟進(jìn)針采血 2 m l,抗凝后室溫靜置 10min,采用離心機加速紅細(xì)胞沉淀(3 000 r/min,15min),取 500μl上清液加入等體積乙腈混勻室溫靜置 10 min充分沉淀血漿中的蛋白質(zhì),然后 15 000 r/min離心 10 min,取上清液,-70℃保存待測。

1.2.2 高效液相色譜法檢測血漿氨基酸含量

1.2.2.1 氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品儲備液制備 用 0.1 mol/L的 HCl制成含每種氨基酸濃度為 0.125,0.25,1.25,2.5μmol/m l的 4種混合氨基酸儲備液,4℃冰箱保存。

1.2.2.2 鄰苯二甲醛(OPA)衍生試劑的制備20mg OPA以 5ml甲醇溶解,加入 50μl巰基乙醇,混勻,4℃冰箱保存,3 d內(nèi)使用。

1.2.2.3 色譜條件 SinoChrom ODS-BPC18色譜柱(5μm,250 mm×4.6mm,大連伊利特公司);流動相 A液為 0.02mol/L醋酸鈉(pH7.2)-四氫呋喃-三乙胺(99∶1∶0.1),流動相 B為甲醇-乙腈-0.02 mol/L醋酸鈉(pH 7.2)(175∶225∶100);梯度程序以純 A液開始,遞增 B液百分比,具體增幅如下:0 min,100%A;17 min,50%B;19 min,50%B;21 min,100%B;21.5 min,100%B;22 min,100%A。流速1.0ml/min;檢測波長 338 nm,柱溫 25℃。

1.2.2.4 測定 取不同濃度氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品 20μl,加 OPA試劑 40μl,硼酸緩沖液(pH 8.5)180μl,充分混勻后,室溫進(jìn)行衍生化反應(yīng) 10min后,0.45μm濾過膜濾過取 20μl進(jìn)樣。以標(biāo)準(zhǔn)氨基酸濃度對峰面積作為標(biāo)準(zhǔn)曲線,得出 8種氨基酸的線性回歸方程,以此對未知樣品定量分析。依上述方法對各種血漿樣品逐一測定,經(jīng)線性方程計算得出樣品中各種氨基酸的含量。

1.2.3 透射電鏡觀察肝細(xì)胞自噬泡 經(jīng)過常規(guī)取材、雙重固定、脫水、浸透、包埋、切片(厚度為 50 nm)、醋酸雙氧鈾和枸櫞酸鉛雙重染色后,透射電鏡觀察、拍照、記錄。采用 Image-Pro Plus6.0軟件計算電鏡照片中各個細(xì)胞中自噬泡占細(xì)胞質(zhì)總面積的比例。

2 結(jié)果

2.1 大鼠血漿氨基酸測定

2.1.1 氨基酸類型的確定 采用高效液相色譜法檢測血漿氨基酸含量結(jié)果見圖 1。

2.1.2 氨基酸的濃度 B組和 C組中的纈氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸和賴氨酸的濃度較 A組明顯降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01),兩組之間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。其他氨基酸三組間比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(見表1)。

2.2 細(xì)胞自噬的檢測

2.2.1 電鏡觀察 A組肝臟細(xì)胞核內(nèi)染色質(zhì)分布均勻,核仁明顯;脂滴較多,線粒體嵴結(jié)構(gòu)清晰,粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分布在細(xì)胞質(zhì),自噬溶酶體少見。B組肝臟細(xì)胞核內(nèi)染色體輕度凝集、邊聚,核仁可見,細(xì)胞質(zhì)內(nèi)線粒體豐富,腫脹明顯,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)輕度擴張,自噬溶酶體數(shù)量較多。C組肝臟細(xì)胞核圓形,核內(nèi)染色質(zhì)輕度邊聚,線粒體豐富,線粒體輕度腫脹,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)輕度擴張,自噬溶酶體較多。自噬泡為單層或雙層膜包裹著的處于不同降解階段的胞質(zhì)成分或廢棄的細(xì)胞器經(jīng)消化降解后形成的板層樣結(jié)構(gòu) (見圖2)。

圖1 8種必需氨基酸的 HPLC圖譜(0.25μmol/ml)Fig 1 HPLC chromatograms of essential amino acids(0.25μmol/m l)

表1 不同組大鼠血漿必需氨基酸含量 (±s,n=10,nmol/ml)Tab 1 Contents of essential am ino acids in rat serum in different groups

表1 不同組大鼠血漿必需氨基酸含量 (±s,n=10,nmol/ml)Tab 1 Contents of essential am ino acids in rat serum in different groups

與 A組比較,*P＜0.01,**P＜0.001

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圖2 各組大鼠肝臟細(xì)胞自噬透射電鏡觀察及典型自噬泡Fig 2 The autophagy of rat hepatocytes and the typicalautophagosomes under TEM

2.2.2 自噬泡占細(xì)胞質(zhì)總面積的比值 經(jīng) Image-Pro Plus6.0軟件計算各組細(xì)胞電鏡照片中自噬泡占胞質(zhì)總面積的比值,結(jié)果顯示:B組(0.029 2±0.018 8)和 C組 (0.045 2±0.019 6)均較 A組(0.008 9±0.004 1)明顯增加,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01);B組和 C組兩者之間該比值無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)。

2.3 血漿氨基酸濃度與細(xì)胞自噬程度的關(guān)系 采用 Spearman秩相關(guān)計算血漿氨基酸濃度和自噬泡占細(xì)胞質(zhì)總面積的比值的相關(guān)性,結(jié)果顯示纈氨酸與細(xì)胞自噬相關(guān)性最大(r=-0.779,P＜0.01),賴氨酸相關(guān)性最小(r=-0.517,P＜0.01),苯丙氨酸、蛋氨酸、亮氨酸與細(xì)胞自噬的相關(guān)系數(shù)分別為-0.566,-0.527和 -0.531,均 P＜0.01。其余氨基酸與細(xì)胞自噬無相關(guān)性。

3 討論

細(xì)胞自噬是生物在發(fā)育、老化過程中存在的一個凈化自身受損蛋白質(zhì)或細(xì)胞器的機制,貫穿于正常細(xì)胞生長發(fā)育和生理病理過程,對于維持蛋白質(zhì)代謝平衡及細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定起重要的作用,在防止神經(jīng)退行性病變、腫瘤、病原微生物感染等疾病及延長壽命起積極作用[3],因此對細(xì)胞自噬作用的研究不僅有理論意義也具有重要的應(yīng)用價值。

隨著年齡的增加自噬功能下降造成異常蛋白質(zhì)、DNA以及細(xì)胞器進(jìn)行性的積聚,這些積聚的蛋白質(zhì)分子是老化與許多急、慢性疾病的主要病因[2]。在大鼠長期的刺激自噬可延緩衰老[4]。腫瘤細(xì)胞中自噬能力明顯低于正常細(xì)胞,因其對血漿氨基酸降低或高細(xì)胞密度等因素反應(yīng)遲鈍[5]?？梢妼ψ允烧T導(dǎo)或抑制的研究具有重要的意義。細(xì)胞自噬信號的調(diào)控目前研究較多的是 mTOR信號途徑[2]。TOR激酶是氨基酸、ATP和激素的感受器,對細(xì)胞生長具有重要調(diào)節(jié)作用,抑制自噬的發(fā)生,是自噬的負(fù)調(diào)控分子[6]。自噬的消長受多因素的影響[7],饑餓(尤其是氨基酸減少)、胰高血糖素可以誘導(dǎo)自噬;胰島素抑制自噬。他們的作用點在于影響血漿氨基酸的濃度,當(dāng)氨基酸濃度降低時,自噬啟動;相反自噬被抑制[2,4]。細(xì)胞自噬活性隨年齡增加而下降,這種下降可能與年齡相關(guān)的消化吸收后氨基酸水平的增加和/或基礎(chǔ)水平胰島素受體信號傳導(dǎo)途徑的增加有關(guān)[8]。推斷當(dāng)氨基酸水平升高時激活 TOR激酶抑制了自噬的發(fā)生,相反則激活自噬[4]。由此可見血漿氨基酸水平和細(xì)胞自噬的程度密切相關(guān),探討從血漿氨基酸水平調(diào)節(jié)細(xì)胞自噬程度的研究目前國內(nèi)外較少。

本實驗采用兩種不同的禁食方式使大鼠定期處于饑餓狀態(tài),經(jīng)過一段時間干預(yù)后檢測大鼠血漿中必需氨基酸的濃度,結(jié)果顯示兩干預(yù)組中纈氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸和賴氨酸的濃度較對照組明顯降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義,而兩組之間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義,其余必需氨基酸三組間比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。計算自噬泡占胞質(zhì)總面積的比值顯示兩干預(yù)組的該比值明顯大于對照組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義,而兩組之間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。由此可見與正常飲食對照組相比,兩干預(yù)組中纈氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸和賴氨酸的濃度均明顯降低,細(xì)胞自噬程度均明顯增強。但兩種不同的禁食方式對該結(jié)果的影響無統(tǒng)計學(xué)差異。相關(guān)性分析顯示纈氨酸濃度與細(xì)胞自噬程度的相關(guān)性最大,賴氨酸的相關(guān)性最小,苯丙氨酸、蛋氨酸和亮氨酸的濃度與細(xì)胞自噬程度相關(guān)系數(shù)介于二者之間。通過實驗我們可知定期饑餓可降低某些血漿必需氨基酸濃度和增強細(xì)胞發(fā)生自體吞噬的程度,相關(guān)性分析顯示這些必需氨基酸的濃度和細(xì)胞自噬的程度呈負(fù)相關(guān),其中纈氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、亮氨酸和賴氨酸的濃度對細(xì)胞自噬的程度影響較大,實驗采用的兩種不同禁食方式對血漿氨基酸及細(xì)胞自噬的影響無明顯的統(tǒng)計學(xué)差異。我們推測通過調(diào)節(jié)血漿氨基酸的水平來調(diào)控細(xì)胞自噬將是細(xì)胞自噬在臨床應(yīng)用中的一個方向。低血漿氨基酸水平是否通過抑制 TOR激酶激活了 mTOR信號途徑進(jìn)而增強了細(xì)胞發(fā)生自體吞噬及其相應(yīng)的細(xì)胞機制和非必需氨基酸對細(xì)胞自噬的影響等將有待于進(jìn)一步研究。

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