槲皮素和8-Br-cAMP對腫瘤增變基因表型改變的影響

李 璇

腫瘤的增變基因表型（mutator phenotype）學(xué)說主要是指由于調(diào)控DNA穩(wěn)定/修復(fù)基因的突變（mutator增變子）而引起監(jiān)督DNA損傷的抑癌基因，如p53、p16等基因的失活/突變而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞對多藥耐藥性（MDR）增加和抗凋亡等腫瘤惡性的表型。

在失去生長、增殖調(diào)控的腫瘤細(xì)胞內(nèi)PKC信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑呈激活狀態(tài)，而在PKA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中PKAⅡ型受體處于失激活狀態(tài)。槲皮素（類黃酮）具有阻抑PKC/TPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的作用。8-Br-cAMP是PKARⅡ的激動(dòng)劑。本文主要探討了槲皮素和8-Br-cAMP單獨(dú)作用或聯(lián)合應(yīng)用是否可呈現(xiàn)不同信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的互補(bǔ)效應(yīng)和對增變基因表型變動(dòng)的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 Bcl-2單克隆抗體（Santa Cruz）、Bax、XRCC1單克隆抗體（Lab Vision），TUNEL凋亡試劑（Promega），8-BrcAMP（Sigma），槲皮素（上海試劑二廠）；POLB單克隆抗體（Lab Vision），MRP單克隆抗體（Zymed）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及分組 將培養(yǎng)的Eca-109細(xì)胞隨機(jī)分為4組：①8-Br-cAMP（Br）組，加終濃度為2×10-5mol/L的8-BrcAMP；②槲皮素（Q）組，加槲皮素終濃度為43 μmol/L；③8-Br-cAMP和槲皮素共同作用（Br+Q）組，加終濃度為2×10-5/L的8-Br-cAMP和槲皮素終濃度為43 μmol/L；④對照組（C），僅加DMEM培養(yǎng)液（含10%胎牛血清）。各組細(xì)胞均培養(yǎng)48 h后收集細(xì)胞，制成1×107/ml細(xì)胞懸液滴加至預(yù)先處理過的玻片和硝酸纖維素膜（NCM）上。

1.3 細(xì)胞凋亡率檢測 應(yīng)用TUNEL法檢測各組細(xì)胞的凋亡率。

1.4 蛋白免疫反應(yīng)性的檢測 應(yīng)用免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)分別對滴片進(jìn)行MRP、POLB、Bcl-2、Bax和XRCC1免疫反應(yīng)性（IR）的強(qiáng)弱和定位觀察。應(yīng)用免疫斑點(diǎn)印跡技術(shù)檢測NCM膜上的POLB、MRP、Bcl-2、Bax和XRCC1的印跡并應(yīng)用薄層層析掃描儀（Shimadu）以470 nm波長進(jìn)行掃描。計(jì)總積分值。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS10.0軟件，計(jì)量資料用單因素方差分析，結(jié)果判定以α=0.05為水準(zhǔn)。

2 結(jié) 果

2.1 各組細(xì)胞凋亡率 C組為4%，Br組為42%，Q組為35%，（Br+Q）組為70%，見圖1～4。（Br+Q）組>Br組或Q組>C組，P<0.01。

2.2 Bcl-IR、Bax-IR和XRCC1-IR Bcl-IR和Bax-IR呈棕黃色顆粒，位于胞質(zhì)內(nèi)；XRCC1-IR呈棕黃色顆粒，多位于胞核，也可見到有些細(xì)胞的整個(gè)細(xì)胞呈陽性反應(yīng)。四個(gè)實(shí)驗(yàn)組的免疫組化信號(hào)強(qiáng)弱積分值見表1。

2.3 各組Eca-109細(xì)胞的Bcl-2-IR、Bax-IR和XRCC1-IR的相關(guān)性 Bcl-2-IR與Bax-IR呈顯著負(fù)相關(guān)，r=-0.984 9，P<0.01；Bcl-2-IR與XRCC1-IR呈顯著正相關(guān)，r=0.992 6，P<0.01；Bax-IR與 XRCC1-IR呈顯著負(fù)相關(guān)，r=-0.996 2，P<0.01。

圖1 Br組Eca-109細(xì)胞凋亡增加 TUNEL，×1000

圖2 Q組Eca-109細(xì)胞凋亡增加 TUNEL，×1000

圖3 （Br+Q）組Eca-109細(xì)胞凋亡顯著增加 TUNEL，×1000

圖4 C組Eca-109細(xì)胞凋亡很少見 TUNEL，×1000

表1 各組細(xì)胞Bcl-2、Bax、XRCC1-IR積分

2.4 各組免疫斑點(diǎn)印跡薄層色譜掃描數(shù)值 見表2。

表2 各組免疫斑點(diǎn)印跡掃描數(shù)值

2.5 各組Eca-109細(xì)胞的POLB-IR、MRP-IR表達(dá)及積分POLB-IR呈棕黃色顆粒，多位于胞核，也可見到有些細(xì)胞的整個(gè)細(xì)胞呈陽性反應(yīng)。MRP-IR呈棕黃色顆粒主要位于細(xì)胞質(zhì)。四個(gè)實(shí)驗(yàn)組的免疫組化信號(hào)強(qiáng)弱的積分值見表3；MRP與POLB呈顯著正相關(guān)，r=0.983 8，P<0.01。

表3 各組細(xì)胞POLB、MRP-IR積分值

2.6 各組免疫斑點(diǎn)印跡薄層色譜掃描數(shù)值 POLB C組免疫斑點(diǎn)印跡薄層色譜掃描數(shù)值為109，Br組為72，Q組為25，（Br+Q）組為34；MRP C組免疫斑點(diǎn)印跡薄層色譜掃描數(shù)值為111，Br組為37，Q組為30，（Br+Q）組為54。

3 討 論

Bcl-2位于線粒體膜內(nèi)層，可防止線粒體膜的非特異性滲透而提高ADP/ATP的交換[1]。前凋亡（pro-apoptotic）的Bax蛋白是Bcl-2家族成員之一，通過同源或異源二聚體調(diào)控線粒體功能和調(diào)控細(xì)胞凋亡。Bax·Bcl-2異二聚體抑制細(xì)胞凋亡，而Bax·Bax同源二聚體則促進(jìn)細(xì)胞凋亡[2-5]。有報(bào)道Bcl-2/Bax的比例可預(yù)示急性髓性白血?。ˋML）預(yù)后的結(jié)果[2]。本實(shí)驗(yàn)觀察到Eca-109對照組細(xì)胞Bcl-2-IR/Bax-IR的比值高約為4.3，在應(yīng)用Br、Q或（Br+Q）處理后其比值下降分別為1.1、1.0和1.1，表明Bcl-2-IR/Bax-IR比值下降的改變可導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。XRCC1是DNA修復(fù)蛋白，是DNA polβ聚合酶的異二聚體蛋白，對DNA單鏈斷裂損傷具有修復(fù)作用，修復(fù)蛋白覆蓋于DNA損傷處，可防止核酸酶的消化而具有抗細(xì)胞凋亡作用。本實(shí)驗(yàn)中XRCC1-IR與Bcl-2-IR呈顯著正相關(guān)，二者與Bax-IR皆呈顯著負(fù)相關(guān)，這結(jié)果進(jìn)一步表明XRCC1具有抗細(xì)胞凋亡作用，與Guo等[5]檢測正常肝和肝癌細(xì)胞的bax、bcl-2、bcl-XL的表達(dá)水平和相關(guān)性研究及這些凋亡相關(guān)蛋白對細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)作用相似。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用Br和Q聯(lián)合誘導(dǎo)Eca-109細(xì)胞凋亡后bcl-2及XRCC1表達(dá)的下調(diào)，Bax表達(dá)的上調(diào)對該細(xì)胞凋亡起著調(diào)節(jié)作用；而且Br及Q的單獨(dú)和聯(lián)合用藥對Bcl-2-IR、Bax-IR或XRCC1-IR的影響無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但細(xì)胞凋亡率，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。該結(jié)果提示植物類黃酮的中藥與西藥聯(lián)合應(yīng)用可能更具有臨床應(yīng)用意義。

藥物耐藥性在臨床療效上是一個(gè)重要因素，已知wtp53與細(xì)胞凋亡和耐藥性密切相關(guān)，此外，調(diào)控蛋白如：Bcl-2和Bax等可能參與藥物耐藥性機(jī)制。有報(bào)道乳腺癌細(xì)胞系的凋亡與Bcl-2蛋白表達(dá)和Caspase-3活性有關(guān)，但與Bax和Bcl-Xs無關(guān)[6]。研究結(jié)果表明多藥耐藥性相關(guān)蛋白免疫反應(yīng)性與Bcl-2-IR呈正相關(guān)，與Bax-IR呈負(fù)相關(guān)。提示：一方面Bcl-2與Bax可能皆參與Eca-109細(xì)胞的凋亡，另一方面前凋亡蛋白的Bax可能對8-Br-cAMP及槲皮素誘導(dǎo)凋亡藥物的敏感性較高，細(xì)胞的MRP表達(dá)減低。相反，Bcl-2可能對促凋亡誘導(dǎo)藥物的敏感性較低，有一定程度的耐藥性而提高M(jìn)RP的表達(dá)。POLB主要是DNA損傷中最常見的DNA單核苷酸的切除修復(fù)酶，當(dāng)高表達(dá)時(shí)，則對基因毒性藥物，如順鉑，敏感性降低而藥物耐藥性增高。有報(bào)道人卵巢癌細(xì)胞對順鉑耐藥的細(xì)胞比不耐藥的細(xì)胞POLB表達(dá)水平高3倍[7]；結(jié)腸癌細(xì)胞對順鉑等藥物耐藥性比對照的POLB表達(dá)高2.5倍[8]；類似報(bào)道也見于乳腺癌細(xì)胞[9]。本文結(jié)果表明 8-BrcAMP及槲皮素的聯(lián)合用藥可顯著降低不加藥的Eca-109細(xì)胞的POLB表達(dá)，同時(shí)也下調(diào)MDR表達(dá)。兩者之間呈顯著正相關(guān)，r=0.983 8，P<0.01。即降低了該細(xì)胞的藥物耐藥性，逆轉(zhuǎn)腫瘤惡性。槲皮素和8-Br-cAMP可抑制癌細(xì)胞周期進(jìn)展和增殖，提高藥物敏感性，誘導(dǎo)食管癌細(xì)胞分化及凋亡，呈現(xiàn)不同信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的互補(bǔ)效應(yīng)，提示其下調(diào)Eca-109細(xì)胞的增變基因表型。

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