綿羊前體脂肪細胞的原代培養(yǎng)及分化

蔡 勇 阿依木古麗 楊具田 馬忠仁 盧建雄 臧榮鑫 吳建平

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學動物科學技術學院,蘭州 730070;2.西北民族大學實驗中心,蘭州 730030;3.西北民族大學生命科學與工程學院,蘭州 730030)

綿羊前體脂肪細胞的原代培養(yǎng)及分化

蔡 勇1,2阿依木古麗3楊具田3馬忠仁3盧建雄3臧榮鑫3吳建平1*

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學動物科學技術學院,蘭州 730070;2.西北民族大學實驗中心,蘭州 730030;3.西北民族大學生命科學與工程學院,蘭州 730030)

本試驗旨在建立綿羊前體脂肪細胞的原代培養(yǎng)方法,探討反芻動物脂肪沉積機理。以1日齡羔羊的腎周脂肪組織為試驗材料,采用組織塊法和酶消化法分離培養(yǎng)前體脂肪細胞,觀察形態(tài)學變化,測定生長曲線,油紅O染色檢測細胞內(nèi)脂肪含量,并用實時定量PCR法檢測脂蛋白脂酶、過氧化物體增殖劑活化受體γ、脂肪酸合酶的表達量。結(jié)果表明:原代培養(yǎng)的細胞成分均一、增殖旺盛、分化率高,具有前體脂肪細胞的形態(tài)特征和基因表達特性,為綿羊前體脂肪細胞。本試驗成功建立了綿羊前體脂肪細胞原代培養(yǎng)方法,并在體外重現(xiàn)了增殖和分化的過程。

綿羊;前體脂肪細胞;原代培養(yǎng);分化

脂肪組織不僅具有儲能功能,而且具有重要的內(nèi)分泌功能,其代謝失?？梢鸶视腿バ罘e過多,導致肥胖、胰島素抵抗、動脈粥樣硬化、Ⅱ型糖尿病等多種肥胖相關疾病的發(fā)生[1]。家畜過度沉積脂肪會降低其產(chǎn)品質(zhì)量,增加飼養(yǎng)成本。因此,認識脂肪形成的規(guī)律和機制,調(diào)控體脂沉積并改善動物產(chǎn)品質(zhì)量在畜牧業(yè)生產(chǎn)中具有重要意義。

前體脂肪細胞(preadipocyte)是脂肪細胞的前體細胞,是研究脂肪形成(adipogenesis)機理的理想模型,通過培養(yǎng)前體脂肪細胞,能夠在體外重現(xiàn)脂肪細胞的發(fā)生、增殖和分化的全過程,同時也便于觀察各種因素對整個過程的影響,探討脂肪形成機理,最終達到對脂肪形成的有效控制。國內(nèi)外已建立了來源于鼠前體脂肪細胞的細胞系,如 3T3L1、3T3F442A、ob17等[2],也開展了大鼠[3]、人[4]、豬[5]、雞[6]、草魚[7]和牛[8]前體脂肪細胞原代培養(yǎng)體系的研究,但尚未見綿羊前體脂肪細胞分離培養(yǎng)的相關報道。本試驗在借鑒國內(nèi)外人及其他動物前體脂肪細胞體外原代培養(yǎng)技術的基礎上,以蘭州大尾羊為動物模型,建立綿羊前體脂肪細胞的體外原代培養(yǎng)體系,為進一步研究反芻動物脂肪沉積機理奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

臨床檢查無異常的新生1日齡蘭州大尾羊,頸部放血致死,無菌條件下取腎及腎周脂肪組織,低溫運輸,1 h送至實驗室進行試驗。

1.2 培養(yǎng)液及主要試劑的配制

DMEM/F12培養(yǎng)液:稱取 15.60 g DMEM/F12(G ibco),3.50 g NaHCO3,10m L胎牛血清(民海生物),蒸餾水定容至1 L。不加入胎牛血清即為無血清培養(yǎng)液。

紅細胞裂解液[3]:8.24 g NH4 C l,0.70 g KHCO3,29.22 mg EDAT,蒸餾水定容至1 L。

膠原酶消化液[3]:0.10 gⅠ型膠原酶(Sigm a)和2.00 g牛血清白蛋白溶于100m L無血清培養(yǎng)液中。

胰蛋白酶消化液:稱取0.25 g胰蛋白酶溶于100m L的無血清培養(yǎng)液中。上述溶液均調(diào)整pH至7.2～7.4,0.22μm微孔濾膜正壓過濾除菌,分裝后置-20℃保存。

1.3 前體脂肪細胞培養(yǎng)方法篩選[9]

組織塊培養(yǎng)法:無菌條件下取新生羊腎周脂肪組織約3 g,用PBS緩沖液沖洗3次,剪去脂肪組織中可見的血管和其他結(jié)締組織,并將脂肪組織剪成1mm3左右的小塊,均勻地擺放在25 m L培養(yǎng)瓶中,37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),4 h后加入DMEM/F12培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。

膠原酶消化培養(yǎng)法:將脂肪組織處理成1mm3左右的小塊,轉(zhuǎn)移至含有玻璃珠的25m L三角燒瓶中,加入1 mg/m L的Ⅰ型膠原酶消化液,置于37℃水浴中消化50min(每5 m in振蕩1次),過孔徑為200目的鋼篩,1 000 r/m in離心5m in棄上清,加入紅細胞裂解液,吹打均勻,室溫靜置 10 m in,1 000 r/m in離心5m in,棄上清液,用培養(yǎng)液重懸,1 000 r/m in離心5 min,棄上清液,加入培養(yǎng)液并吹打均勻,即為綿羊前體脂肪細胞。臺盼藍染色計數(shù),按5×104個/m L的濃度接種于96孔和24孔培養(yǎng)板中,37℃,5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),每2 d換液1次,并在顯微鏡下進行觀察、照相。

1.4 細胞傳代培養(yǎng)及誘導分化

原代培養(yǎng)的前體脂肪細胞達到80%～90%匯合時,用胰蛋白酶消化液消化0.5～3.0m in,用含血清培養(yǎng)液終止消化,按1︰3的比例進行傳代培養(yǎng)。傳代培養(yǎng)過程中,每2 d更換1次培養(yǎng)液,直至細胞匯合并鋪滿整個培養(yǎng)皿后,再重復上述操作。第4代培養(yǎng)至80%匯合時,換用誘導分化培養(yǎng)液[DMEM/F12培養(yǎng)液中添加5μg/m L的牛胰島素(Sigma)、50μg/m L的轉(zhuǎn)鐵蛋白質(zhì)、5 ng/m L亞硒酸鈉和50 ng/m L的氫化可的松]進行誘導分化。

1.5 MTT比色法檢測細胞活力[10]

將原代細胞懸液按每孔103～104個細胞接種于96孔培養(yǎng)板中(0 d),自第1天起,每隔2 d在同一時間取 8孔,在每孔中加 20μL噻唑藍溶液(M TT,5m g/m L、PBS配制),繼續(xù)培養(yǎng)4 h后終止培養(yǎng),棄去孔內(nèi)溶液后每孔加150μL二甲基亞砜(DMSO),避光震蕩10m in,在酶聯(lián)檢測儀上測定各孔OD490nm值,以時間為橫坐標,OD490nm值(表示細胞相對數(shù)量)為縱坐標繪制生長曲線。

1.6 油紅O染色及脂肪含量的測定

脂肪細胞的油紅O染色按照盧建雄等[10]的方法進行,細胞內(nèi)脂肪含量的測定參考Ram irez等[11]使用的方法,通過測定萃取液OD510nm值來衡量細胞內(nèi)的脂肪含量。

1.7 引物設計與合成、實時定量PCR

根據(jù)GenBank中登錄的綿羊脂蛋白脂酶(lipoprotein lipase,LPL,X 68308)、過氧化物體增殖劑活化受體γ(peroxisome proliferators-activated receptorγ,PPARγ,AY 137204)、脂肪酸合酶(fatty acid synthase,FAS,AB011671)和 β-肌動蛋白(β-actin,NM_001009784)基因序列,用 Primer Prem ier 5.0軟件設計引物(表1),引物由上海生工生物工程有限公司合成。

用TRIzo l提取細胞總RNA,經(jīng)瓊脂糖電泳檢測后立即按照試劑盒說明書進行反轉(zhuǎn)錄。用反轉(zhuǎn)錄的cDNA第一鏈為模板進行實時定量PCR(realtime PCR,RT-PCR)(SLAN熒光定量PCR儀)。反應體系為 25μL體系(SYBR Premax Tag 12.5μL、上下游引物各0.25μL、cDNA樣品2μL,水補足至 25μL)。反應條件為:95.0℃預變性10 s、95.0 ℃變性5 s、54.0 ℃退火及延伸 25 s,40個循環(huán)。每個循環(huán)的退火及延伸階段采集熒光信號數(shù)據(jù)。擴增結(jié)束后立即進行溶解曲線分析,從60.0℃開始每30 s升高1.0℃,直到94.0℃結(jié)束,共35個循環(huán),每個循環(huán)待溫度恒定后5 s采集熒光信號數(shù)據(jù),系統(tǒng)自動分析數(shù)據(jù)后生成溶解曲線報告。反應結(jié)束后系統(tǒng)根據(jù)梯度稀釋模板的擴增情況自動繪制標準曲線,以 β-actin做內(nèi)參用 ΔCt法[12]進行分析細胞培養(yǎng)過程中脂肪細胞分化標志基因的表達情況。

表1 引物序列與RT-PCR反應參數(shù)Tab le 1 Prim er sequences and RT-PCR reaction parameters

1.8 試驗設計與數(shù)據(jù)處理

所有試驗均設置5次重復,試驗所得數(shù)據(jù)以平均值±標準差表示,采用SPSS 11.5統(tǒng)計分析軟件中的One-w ay ANOVA進行方差分析,Duncan氏方法進行多重比較,顯著性水平定為P＜0.05。

2 結(jié) 果

2.1 綿羊前體脂肪細胞的形態(tài)學觀察

經(jīng)膠原酶消化后的綿羊前體脂肪細胞為圓形,3 h后細胞開始貼壁,2 d細胞呈梭形纖維狀、三角形或不規(guī)則形狀(圖1),4 d形成單層匯合,部分細胞內(nèi)出現(xiàn)微小脂滴(圖2),6 d分化的細胞增多,并可見散在分布的大小不等的脂滴(圖3),9 d脂滴逐漸融合,細胞核位于邊緣,之后細胞停止生長,脂滴逐漸變得灰暗,部分細胞脫落,浮于培養(yǎng)液內(nèi)(圖4)。

組織塊法培養(yǎng)綿羊前體脂肪細胞,4 d可觀察到組織塊邊緣游離出少量梭形或不規(guī)則形成纖維樣細胞(圖5),6 d左右大量增殖,圍繞脂肪塊呈漩渦狀排列,并逐漸形成局部單層匯合,積聚脂肪顆粒(圖6)。組織塊法培養(yǎng)的前體脂肪細胞分布不均,9 d時部分區(qū)域細胞形成匯合,細胞內(nèi)充滿脂滴,而有的區(qū)域細胞呈梭形或三角形,處于分裂增殖狀態(tài),由于細胞從組織塊中游離出的時間不同,細胞增殖和分化不同步(圖 7)。經(jīng)油紅O染色的脂肪細胞在顯微鏡下觀察,脂滴被親脂的油紅O著色而呈橘紅色,表明具有脂肪細胞的特征(圖8)。

圖8 組織塊法培養(yǎng)9 d經(jīng)油紅O染色的脂肪前體細胞(200×)Fig.8 Morphology of preadipocyte cultured by explantingmethod and stained with oil red O(200×)

2.2 前體脂肪細胞的傳代培養(yǎng)及誘導分化

細胞傳代后2 h內(nèi)貼壁,傳代細胞與原代細胞形態(tài)一致(圖9),增殖速度較原代細胞明顯增快,2～3 d即可達到單層匯合。再次傳代后細胞自主分化為脂肪細胞的能力逐漸減弱,4代后,幾乎沒有細胞分化為脂肪細胞,但改用誘導分化培養(yǎng)液培養(yǎng)后,細胞內(nèi)出現(xiàn)大小不等的脂滴(圖10),表明細胞分化能力有所恢復。

圖9 第4代的前體脂肪細胞形態(tài)(200×)Fig.9 Morphology of the 4th generation of preadipocy tes(200×)

2.3 M TT比色法繪制生長曲線

由圖11可見,曲線呈“S”型,3～9 d為指數(shù)生長期,之后便進入平臺期。綿羊前體脂肪細胞的倍增時間為54.6 h。

2.4 細胞內(nèi)脂肪含量的變化

由圖12可見,隨培養(yǎng)時間增加,細胞內(nèi)脂肪含量逐漸增加,在原代培養(yǎng)的前3天,幾乎見不到脂滴,OD510 nm值接近于 0;培養(yǎng)4 d后,極小部分細胞內(nèi)出現(xiàn)微小脂滴,OD510 nm值開始上升,細胞內(nèi)脂滴逐漸沉積,5～11 d期間OD510 nm值呈線性上升,11 d后脂滴沉積速度開始變慢,與形態(tài)學觀察結(jié)果一致。

2.5 前體脂肪細胞分化過程中標志基因表達情況

圖12 前體脂肪細胞分化過程中細胞內(nèi)脂肪含量的變化Fig.12 Changes of fat contents in cells during the preadipocy tes dif ferentiation

如圖13所示,LPL和PPARγ在前體脂肪細胞分化的早期(培養(yǎng)3 d)就有表達,但顯著低于分化中期(7 d)和分化后期(11 d)(P＜0.05)。FAS在3 d時表達量極少,到7 d顯著增加(P＜0.05)并達到最大值,11 d時又顯著降低(P＜0.05)。

圖13 綿羊前體脂肪細胞分化過程中LPL、PPARγ和FAS基因的表達情況Fig.13 LPL,PPARγand FAS gene expression during the ovine preadipocyte differentiation

3 討 論

3.1 綿羊前體脂肪細胞體外培養(yǎng)體系的構(gòu)建

細胞體外分離培養(yǎng)是研究復雜的生物系統(tǒng)的重要手段,通過分離培養(yǎng)綿羊前體脂肪細胞,在體外重現(xiàn)增殖分化過程,是研究反芻動物脂肪形成機理的重要途徑。本試驗通過酶消化法和組織塊培養(yǎng)法獲得了綿羊前體脂肪細胞。發(fā)現(xiàn)組織塊培養(yǎng)法具有操作簡便、不易污染、成本較低、成功率高等優(yōu)點,但細胞培養(yǎng)時間較長,獲取細胞的數(shù)量有限,并且細胞增殖和分化時間不一致,細胞均一性差,不便于試驗處理;酶消化法能一次性獲取大量的前體脂肪細胞,并且細胞均勻一致,便于試驗處理。在原代培養(yǎng)和傳代培養(yǎng)中,應用脂肪細胞貼壁時間長、胰蛋白酶消化時間短的特點,進行差速貼壁和差速消化的方法可對其進一步純化[13],便能得到大量純度高、均勻一致的前體脂肪細胞。在試驗中我們選用消化法進行培養(yǎng)。

細胞體外培養(yǎng)的主要影響因素是培養(yǎng)液和培養(yǎng)環(huán)境。培養(yǎng)液的選擇上,國內(nèi)外各個實驗室不盡相同,DMEM[5-6]、DMEM/F12[4,7]、M 199 在不同物種的前體脂肪細胞的培養(yǎng)中均有應用,我們對不同的培養(yǎng)液做了預篩選后,因DMEM/F12對綿羊前體脂肪細胞的增殖、分化和脂滴沉積均優(yōu)于其他培養(yǎng)基,而被采用,這與牛[8]、大鼠[3]、人[4]和草魚[7]的研究結(jié)果一致,而與豬[5]和雞[6]的不同,這可能是物種之間的差異所致。培養(yǎng)環(huán)境與豬[5]、雞[6]、牛[8]、大鼠[3]和人[4]的前體脂肪細胞一致,37℃、5%CO2及飽和濕度均為最佳條件。

3.2 前體脂肪細胞的增殖和分化

脂肪沉積包括脂肪細胞數(shù)目增加和體積增大。前體脂肪細胞增殖、分化為成熟脂肪細胞、甘油三酯的合成以及脂肪細胞的凋亡,是一系列基因和細胞因子調(diào)控的結(jié)果[14-15]。對脂肪細胞增殖和分化相關基因的研究都是在體外進行的,因此細胞分化的模式也受材料來源、培養(yǎng)基、培養(yǎng)條件等的影響。Ailhaud等[16]認為LPL和PPARγ的表達是脂肪細胞分化的早期標記,LPL的表達預示著脂肪沉積的開始,并且LPL的表達是在細胞匯合時自然發(fā)生的,不依賴于脂肪細胞分化所必需的各種介質(zhì)。在前體脂肪細胞分化的早期,LPL和PPARγ就有表達,但是顯著低于分化中期和分化后期,PPARγ在細胞分化后期才達到表達的高峰。PPARγ的主要異構(gòu)體是脂肪細胞和脂肪組織所特有的,他們在前體脂肪細胞中就能檢測到,在加入誘導分化的激素或介質(zhì)之后表達迅速增加,在成熟的脂肪細胞中達到最高水平[17]。脂肪酸合成酶(FAS)是脂肪酸生物合成的關鍵酶,在動物體內(nèi)的表達受激素和營養(yǎng)等方面的因素調(diào)控[18],是脂肪細胞晚期分化的分子標志[19],他在前體脂肪細胞中不轉(zhuǎn)錄表達,而在分化的脂肪細胞中有較高表達[20],試驗中,培養(yǎng)7 d后細胞的FAS的基因表達量顯著高于3 d的(P＜0.05),這與脂肪沉積的速度相一致。

本試驗培養(yǎng)的原代前體脂肪細胞分離自1日齡羔羊的脂肪組織,培養(yǎng)2 d后就能觀察到大量梭形、三角形或不規(guī)則形狀的成纖維細胞樣細胞——綿羊前體脂肪細胞。前體脂肪細胞在培養(yǎng)過程中不需要誘導即可自動分化為脂肪細胞。但在傳代過程中,這種自動分化能力逐漸減弱,到第4代時幾乎觀察不到充脂的脂肪細胞,但是加入誘導劑后,又可見部分細胞充脂。并且原代前體脂肪細胞自動分化過程中呈現(xiàn)出聚集現(xiàn)象,即分化為成熟脂肪細胞的大多幾個到幾十個聚集在一起,很少見到單個分散存在的細胞分化為脂肪細胞,這有可能是分離前體脂肪細胞時部分細胞處于分化期,在體外培養(yǎng)條件下繼續(xù)分化并分泌有關的激素,通過旁分泌途徑誘導相鄰細胞的分化,但其具體機制有待進一步研究。

綜上所述,本試驗建立了綿羊前體脂肪細胞原代培養(yǎng)的方法,探索了綿羊前體脂肪細胞生長、增殖及分化的生物學特征,在體外重現(xiàn)了其增殖的過程,檢測了相關基因的表達情況,為進一步研究反芻動物脂肪代謝機理奠定了基礎。

4 結(jié) 論

①酶消化法和組織塊培養(yǎng)法均能培養(yǎng)出綿羊前體脂肪細胞,但酶消化法獲得的細胞數(shù)目多且均勻一致,更便于試驗處理。

②綿羊原代前體脂肪細胞在體外含血清的DM EM/F12培養(yǎng)液中能自行分化為脂肪細胞,在分化中后期 LPL、PPARγ和FAS的基因表達增強。

③本試驗初步建立了綿羊前體脂肪細胞原代培養(yǎng)方法,并在體外重現(xiàn)了增殖和分化的過程。

[1] KOPELMAN P G.Obesity as a m edical prob lem[J].Nature,2000,404:635-643.

[2] BILLINGS E,MAY JW.H istorical review and present status of free fat graftauto trans-p lantion in plastic and reconstructive surgery[J].Plastic and Reconstructive Surgery,1989,83(2):368-381.

[3] 孫超.ECM組分和cAMP對大鼠前體脂肪細胞增殖與分化的調(diào)控[D].博士學位論文.楊凌:西北農(nóng)林科技大學,2001.

[4] 王竹晨,劉建中,李燕,等.人前脂肪細胞的原代培養(yǎng)[J].中山醫(yī)科大學學報,2001,22(6):443-446.

[5] 屈長青,張國華,陳粉粉,等.豬前體脂肪細胞的原代培養(yǎng)[J].農(nóng)業(yè)生物技術學報,2005,13(5):649-653.

[6] YOSH IYUKI M,TSUYOSH I E,KO ICH IRO K.Fatty acids but not dexamethasone are essential inducers for chick adipocyte differentiationin vitro[J].Comparative Biochem istry and Physiology:Part A,2008,151:511-518.

[7] 吉紅,曹艷姿,林亞秋,等.草魚前體脂肪細胞的原代培養(yǎng)[J].水生生物學報,2009,33(6):1226-1230.

[8] 夏成,王哲,牛淑玲,等.犢牛前脂肪細胞的培養(yǎng)及其增殖與分化模型的建立[J].中國獸醫(yī)科技,2004,34(5):26-30.

[9] 李影,楊公社,盧榮華.原代豬前體脂肪細胞培養(yǎng)方法的優(yōu)化[J].細胞生物學雜志,2005,27:697-700.

[10] 盧建雄,楊具田,臧榮鑫,等.胰島素對原代培養(yǎng)大鼠前體脂肪細胞增殖分化的影響[J].中國獸醫(yī)科學,2006,36(11):915-919.

[11] RAM IREZ J L,M UNOZLEDO F C,HARCUCH W.Quantitation of adipose conversion and trig lycerides by staining intracytop lasm ic lipidswith oil red O[J].H istochem istry,1992,97:493-497.

[12] LIVAK K J,SCHMITTGEN T D.Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-ΔΔCTmethod[J].Methods,2001,25(4):402-408.

[13] VARZANECH F E,SHILLABEER G,WONG K L,et al.Ex tracellular matrix com ponents secreted by m icrovascular endothelial cells stimulate preadipocyte differentiationinvitro[J].Metabolism,1994,43:906-912.

[14] NAKAM URA T,SHIOJIMA S,HIRA I Y,et al.Temporal gene changes during adipogenesis in hum an m esenchym al stem cells[J].Biochem ical and Biophysical Research Comm unications,2003,303:306-312.

[15] HUNGA S C,FANG C,LI C H,et al.Gene expression profiles of early adipogenesis in human mesenchymal stem cells[J].Gene,2004,340:141-150.

[16] AILHAUD G.Early adipocyte differentiation[J].Biochem ical Society Transactions,1996,24:400-402.

[17] WU Z,BUCHER M,FARMER SR.Induction of peroxisome p roliferators-activated recep tor gamm a during the conversion of 3T3 fibroblasts into adipocytes ismeditated by C/EBP beta,C/EBP delta and glucocorticoids[J].Molecular and Cellu lar Biochemistry,1996,16:4128-4136.

[18] 顏新春,汪以真,許梓榮.動物脂肪酸合成酶(FAS)基因表達的調(diào)控[J].動物營養(yǎng)學報,2002,14(2):1-4.

[19] ERICSSON J,JACKAON SM,KIM JB,et al.I-dentification of glycerol-3-phosphate acyltransferase as an adipocyte determ ination factor 1 and sterol regulatory element-binding protein responsive gene[J].Journal of Bio logical Chem istry,1997,172:7298-7305.

[20] 盧建雄,劉翊中,臧榮鑫,等.大鼠脂肪細胞分化過程中脂代謝相關基因轉(zhuǎn)錄表達時序的研究[J].中國獸醫(yī)科學,2006,36(4):306-310.

*Correspond ing au thor,p rofessor,E-m ail:w ujp@gsau.edu.cn

(編輯 王智航)

Primary Culture and Differentiation ofOvine Preadipocytes

CAIYong1,2Ayimuguli3YANG Jutian3MA Zhongren3LU Jianxiong3ZANG Rongxin3WU Jianping1*

(1.College of Animal Science and Technology,Gansu Agricu ltural University,Lanzhou730030,China;2.Science Experimen tal Center,Nor thwest University for Nationalities,Lanzhou730030,China;3.College of Life Science and Engineering,Northwest Un iversity for Nationalities,Lanzhou730030,Ch ina)

The study w as conduc ted to set up amethod for prim ary culture of ovine p readipocytes,and p robe them echanism of fat deposition in rum inants.Preadipocyteswere isolated from perinephrit fat of 1-day-o ld ovine and cultured by digestive and exp lantingmethods.Themorphological changes of cultured cellswere observed,growth curvew as determ ined,intracellular fat contents weremeasured by themethod of oil red O staining,and LPL,PPARγand FAS expression levels were analyzed by real-tim e PCR.Results showed as follows:primary cultured cells show ed homogeneous cell components,vigorous proliferation and high differentiation ratio and p resented themorpho logy charac teristics and idiotype genes of p readipocytes.All the resu lts verified their preadipocy te identity.In this paper,amethod for p rimary cu lture of p readipocytesw as successfully set,and the processes of proliferation and dif ferentiation were exhibitedin vitro.[Chinese Journal of Animal Nutrition,2010,22(6):1768-1774]

ovine;preadipocyte;primary culture;differentiation

S826

A

1006-267X(2010)06-1768-07

10.3969/j.issn.1006-267x.2010.06.044

2010-06-29

國家自然科學基金項目(30871811);國家民委科研項目(2009-158-09X B02)

蔡 勇(1979—),男,土家族,湖北宜昌人,講師,博士研究生,主要從事生物化學和分子生物學研究。E-mail:caiyong1979@163.com

*通訊作者:吳建平,教授,博士生導師,E-mail:w ujp@gsau.edu.cn