低聚木糖對草魚非特異性免疫功能的影響

龐麗姣 吳志新 熊 娟 張 朋 余劍敏 曲 藝 何超軍 楊 麗 陳孝煊

(華中農(nóng)業(yè)大學水產(chǎn)學院,武漢 430070)

低聚木糖對草魚非特異性免疫功能的影響

龐麗姣 吳志新*熊 娟 張 朋 余劍敏 曲 藝 何超軍 楊 麗 陳孝煊

(華中農(nóng)業(yè)大學水產(chǎn)學院,武漢 430070)

本試驗旨在研究低聚木糖對草魚非特異性免疫功能的影響。將525尾規(guī)格、體重基本一致的健康草魚隨機分為5組(每組設3個重復,每個重復 35尾),分別飼喂在基礎飼料中添加 0(A0組)、1(A1組)、2(A2組)、4(A3組)和6 g/kg(A4組)低聚木糖的飼料。分別于試驗第0天、第7天、第14天、第28天、第56天檢測草魚血液中白細胞吞噬活性,血清溶菌酶、超氧化物歧化酶活性和補體C3含量。在養(yǎng)殖試驗(56 d)結(jié)束后連續(xù)攻毒14 d,計算各組試驗魚攻毒后死亡率。結(jié)果表明,與對照組相比,在整個試驗期內(nèi),各試驗組草魚的各項免疫指標均有不同程度的提高。其中,A3組的白細胞吞噬活性,血清溶菌酶、超氧化物歧化酶活性和補體C3含量均顯著高于A0組(P＜0.05),并分別于第28天、第28天、第 7天、第28天達到最大值,而且其攻毒后死亡率最低。結(jié)果提示,飼料中添加低聚木糖可提高草魚非特異性免疫功能,其最佳添加量為4 g/kg。

低聚木糖;草魚;非特異性免疫功能

近年來,隨著魚類大規(guī)模集約化養(yǎng)殖的發(fā)展,病害也越來越嚴重。因此,水產(chǎn)動物的疾病防治及健康養(yǎng)殖已越來越受到人們的關注。藥物防治只是暫時性的應急手段,廣譜抗生素殺死或抑制了藥敏細菌而保留了耐藥的致病菌,破壞或干擾了魚體或水體原有正常微生物區(qū)系的生態(tài)平衡,從而增加了水產(chǎn)養(yǎng)殖動物感染病菌的機會[1-2]。并且,抗生素在水產(chǎn)養(yǎng)殖動物體內(nèi)的殘留最終會對人體產(chǎn)生危害。因此,世界上許多國家致力于尋找和開發(fā)更為安全有效的動物促生長劑和保健劑。

功能性寡糖(functional oligosaccharides)是一種新型飼料添加劑,其常用的主要有果寡糖(fructooligosaccharides)、低聚木糖(xy lo-oligosaccharides)、甘露寡糖(m annan-oligosaccharides)、寡葡萄糖(gluco-oligosaccharides)、半乳寡糖(galactooligosacchharides)等。功能性寡糖的作用主要有:1)選擇性地增殖腸道有益菌,使腸道有益菌形成競爭優(yōu)勢;2)作為腸道病原微生物的凝集源,阻止病原菌在腸道的黏附;3)作為免疫源引起動物自身免疫應答反應,提高動物自身免疫力[3]。作為一種高效安全的飼料添加劑,功能性寡糖的研究與應用近年來受到廣泛的關注。低聚木糖又稱木寡糖,是以木聚糖為底物通過內(nèi)切木聚糖酶水解木聚糖的 β-1,4糖苷鍵而得到的以木二糖、木三糖為主要成分的低聚木糖混合物。低聚木糖是植物半纖維素的重要成分,一般占到植物干重的7%～30%,而在如小麥、甘蔗、棉花等一些1年生植物的籽殼中,低聚木糖含量高達30%以上[4-6]。低聚木糖作為一種新型的綠色添加劑,具有穩(wěn)定性好、用量小及來源豐富等特點,其對雙歧桿菌等有益菌有高選擇性增殖,提高機體免疫力及促進生長等作用。目前,低聚木糖在水產(chǎn)動物方面的研究較少,尤其是低聚木糖對魚體非特異性免疫功能方面的研究。草魚是我國主要養(yǎng)殖魚類,但其抗病力差,與草魚相關的疾病很多,嚴重制約其養(yǎng)殖。本試驗以草魚為研究對象,研究低聚木糖對草魚非特異性免疫功能的影響,為其在水產(chǎn)健康養(yǎng)殖中的應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗魚及試驗條件

試驗魚購自武漢市水產(chǎn)良種站,選擇體質(zhì)健壯、無病無傷、規(guī)格基本一致的體重在50 g左右的草魚(Ctenopharyngodon idellus)。試驗魚飼養(yǎng)于華中農(nóng)業(yè)大學水產(chǎn)養(yǎng)殖基地,水缸體積為300 L,采用流水養(yǎng)殖,全天24 h充氧。試驗魚用1%的食鹽水消毒,馴養(yǎng)14 d后,開始正式試驗。每日按體重的3%～5%投喂2次(09:00和16:00),整個試驗期間水溫為22～28℃,pH為6.4～7.0。

1.2 試驗設計

取規(guī)格、體重基本一致的健康草魚525尾,隨機分為5組,每組設3個重復,每個重復35尾。對照組(A0組)投喂基礎飼料,試驗組分別飼喂在基礎飼料中添加1(A1組)、2(A 2組)、4(A 3組),6 g/kg(A4組)低聚木糖的飼料,試驗進行56 d。低聚木糖購自于山東龍力生物有限公司,濃度≥95%?；A飼料組成及營養(yǎng)水平見表1。

表1 基礎飼料組成及營養(yǎng)水平(風干基礎)Tab le 1 Com position and nutrient levels of basal diet(air-dry basis) %

1.3 測定指標與方法

1.3.1 樣品采集

試驗開始和結(jié)束時稱重,計算各組試驗魚的增重率和飼料系數(shù)。分別于試驗前(第0天)和試驗開始后第7天、第14天、第28天和第 56天從各組隨機取5尾魚,尾靜脈采血,將所得的血液分為2份,其中一份用肝素抗凝,用于白細胞吞噬活性的測定;另一份首先在室溫下靜置1 h待其凝固后,置4℃冰箱4 h,以2 000 r/m in離心15m in,收集血清,供測定血清溶菌酶、超氧化物歧化酶(SOD)活性和補體C3含量。血清溶菌酶活性參照周顯青等[7]的方法測定,超氧化物歧化酶活性采用南京建成生物研究所生產(chǎn)的試劑盒測定,補體C3含量采用上海玉蘭生物技術有限公司生產(chǎn)的試劑盒測定。

1.3.2 白細胞吞噬活性的測定

將金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)接種在淡水魚類瓊脂培養(yǎng)基(FW A)上,37℃培養(yǎng)36 h,集菌,并用無菌生理鹽水離心洗滌2次,制成菌懸液(1.0×108CFU/m L)。在金黃色葡萄球菌懸液中加入終濃度為0.5%的福爾馬林,37℃滅活24 h。將用福爾馬林滅活的金黃色葡萄球菌菌體作為本試驗中的吞噬原。經(jīng)過平皿法證實此菌已被徹底滅活后,置4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

在0.25m L抗凝血中加入0.1m L濃度為1×108CFU/m L的菌懸液,搖勻后置于28℃恒溫水浴鍋中,孵育1 h。每個血樣做血涂片5張,自然晾干,甲醇固定,姬姆薩(Giemsa)染色2 h,水洗晾干后置油鏡下觀察計數(shù),并按下式計算白細胞吞噬百分比(phagocytic percentage,PP)和吞噬指數(shù)(phagocytic index,PI)。

吞噬百分比(PP,%)=(100個白細胞中參與吞噬的細胞數(shù)/100)× 100;

吞噬指數(shù)(PI)=被吞噬的細菌數(shù)/吞噬細菌的細胞數(shù)。

1.3.3 攻毒后的死亡率

飼養(yǎng)試驗結(jié)束時,各組取40尾魚進行攻毒,按每千克體重1.0×108CFU的注射量(劑量據(jù)預試驗而定),經(jīng)胸鰭基部注射病原性嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophia)活菌,飼養(yǎng)觀察 14 d。記錄感染魚的發(fā)病和死亡情況,對死亡魚進行解剖、細菌分離并確認死因,統(tǒng)計各組的死亡率。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

試驗數(shù)據(jù)以平均值±標準差表示,采用STATISTICA 6.0軟件進行統(tǒng)計分析,組間差異采用Duncan氏多重比較,顯著水平為P＜0.05。

2 結(jié) 果

2.1 低聚木糖對草魚生長性能的影響

由表2可知,低聚木糖能不同程度的提高草魚的生長性能。其中,A3組增重率顯著高于對照組(P＜0.05);各試驗組飼料系數(shù)均低于對照組,且A2組、A3組與對照組差異達顯著水平(P＜0.05)。

表2 低聚木糖對草魚生長性能的影響Tab le 2 Effects of xylo-oligosaccharides on growth perform ance of grass carp

2.2 低聚木糖對草魚白細胞吞噬活性的影響

由表3可知,在試驗第0天和第7天,白細胞吞噬百分比各組間無顯著差異(P＞0.05);在試驗第14天、第 28天和第56天,除第14天的A1組和A4組外,各試驗組的白細胞吞噬百分比均較對照組顯著提高(P＜0.05)。在試驗第0天和第14天,白細胞吞噬指數(shù)各組間無顯著差異(P＞0.05);在試驗第28天和第56天,各試驗組的白細胞吞噬指數(shù)均較對照組有所提高,且第28天的A3組和第56天的A3、A4組還達到了顯著水平(P＜0.05)。此外,各組的白細胞吞噬百分比和吞噬指數(shù)均在第28天達到最大值。

表3 低聚木糖對草魚白細胞吞噬活性的影響Tab le 3 Ef fects of xylo-oligosaccharides on leucocyte phagocy tic activity of grass carp

2.3 低聚木糖對草魚血清溶菌酶活性的影響

由表4可知,在試驗第 7天、第 14天、第 28天和第56天,A3組的血清溶菌酶活性均顯著高于對照組(P＜0.05),同時也高于其他試驗組,并與第7天的A1組、第14天的其他各試驗組、第56天的A2組達到顯著水平(P＜0.05)。此外,在整個試驗期內(nèi),各組的血清溶菌酶活性均出現(xiàn)先升高后降低的趨勢,并均在第28天達到最高值。

表4 低聚木糖對草魚血清溶菌酶活性的影響Table 4 Effects of xylo-oligosaccharides on lysozym e activity in serum of grass carp

2.4 低聚木糖對草魚血清超氧化物歧化酶活性的影響

由表5可知,在試驗第7天和第28天,各試驗組的血清超氧化物歧化酶活性均顯著高于對照組(P＜0.05);在試驗第14天,A2組和A3組的血清超氧化物歧化酶活性均顯著高于對照組(P＜0.05);在試驗第56天,A1組、A2組和A3組的血清超氧化物歧化酶活性均顯著高于對照組(P＜0.05)。在整個試驗期內(nèi),A 2組和A3組的血清超氧化物歧化酶活性在各試驗組間均一直處在較高水平。此外,在整個試驗期內(nèi),各組的血清超氧化物歧化酶活性均出現(xiàn)先升高后降低的趨勢,其中A2組在第14天達到最高值,A3組在第7天達到最高值。

表5 低聚木糖對草魚血清超氧化物歧化酶活性的影響Table 5 Effects of xylo-o ligosaccharides on superoxide dism utase activity in serum of grass carp U/m L

2.5 低聚木糖對草魚血清補體C3含量的影響

由表6可知,在整個試驗期內(nèi),A2和A3的血清補體C3含量均顯著高于對照組(P＜0.05),同時其在各試驗組間也一直處在較高水平。此外,在整個試驗期內(nèi),各組的血清補體C3含量均出現(xiàn)先升高后降低的趨勢,且A2組和A3組均在第28天達到最高值。

表6 低聚木糖對草魚血清補體C3含量的影響Table 6 Ef fec ts of xy lo-oligosaccharides on complement C3 conten t in serum of grass carp g/L

2.6 攻毒后的死亡率

試驗魚經(jīng)嗜水氣單胞菌活菌攻毒14 d后,投喂基礎飼料的對照組和投喂添加1 g/kg低聚木糖飼料的A1組草魚死亡率最高,均達到47.5%;其次是投喂添加 6 g/kg低聚木糖飼料的 A4組,為40.0%;投喂添加2和4 g/kg低聚木糖飼料的試驗組(A2組和A3組)死亡率較低,分別為32.5%和27.5%。

3 討 論

白細胞的吞噬功能是動物非特異性免疫的重要組成部分,因此,通過測定血液中白細胞的吞噬功能,可以反映機體的非特異性免疫狀態(tài)[8],水產(chǎn)動物體內(nèi)的溶菌酶也是一種重要的非特異性防御因子,是魚體生理防御水平的一個重要標志,還可以反映病原菌及其他環(huán)境因素對魚體健康的影響[9]。溶菌酶活性提高,表明吞噬細胞活性增加,魚類的非特異性免疫功能增強。同時,已有研究發(fā)現(xiàn),超氧化物歧化酶活性與生物的免疫水平密切相關,因此,超氧化物歧化酶活性可作為機體非特異性免疫指標來評判免疫刺激劑對機體非特異性免疫功能的影響[10]。補體是機體抵抗微生物感染的重要成分,具有獨特的理化性質(zhì),激活后具有細胞溶解、細胞黏附、調(diào)理、免疫調(diào)節(jié)、介導炎癥反應、中和毒素、免疫復合物溶解和清除等重要的生物學效應,而C3又是補體系統(tǒng)的主要成分[11]。因此本試驗選擇測定上所述幾種指標作為分析魚類非特異性免疫的指標。

有研究指出,低聚木糖可通過對動物腸道內(nèi)雙歧桿菌的高選擇性增殖作用,減少腸道內(nèi)有害菌的數(shù)目,促進腸道理想微生態(tài)的形成[12]。Moura等[13]報道,在斷奶仔豬飼糧中添加低聚木糖可提高腸道內(nèi)容物中的雙歧桿菌和乳酸桿菌數(shù)量。雙歧桿菌具有較強的免疫活性,有益菌的增殖可以促進吞噬細胞的吞噬活性,從而增強機體免疫功能。本試驗結(jié)果表明,當草魚飼料中低聚木糖添加量為4 g/kg時,其血清溶菌酶、超氧化物歧化酶活性均從第7天開始顯著高于對照組,并且血清溶菌酶活性于第28天達到最大值,血清超氧化物歧化酶活性在第7天達到最大值,白細胞吞噬百分比從第14天開始顯著高于對照組。當草魚飼料中低聚木糖添加量為添加量為2和4 g/kg時,其血清補體C3含量從第7天開始顯著高于對照組。有研究表明,甘露寡糖能顯著提高非洲鯰魚(Clarias gariepinus)的嗜中性白細胞活性[14],提高鮭魚(Salmo salar)苗抗鮭氣單胞菌的能力[15],提高奧尼羅非魚(Oreochromisniloticus×O.aureus)的非特異性免疫功能[16]。張紅梅[17]在鯉(Cyprinus carpio)的飼料中添加甘露寡糖,隨著添加比例的增加,鯉血清溶菌酶和超氧化物歧化酶活性增加,其中0.3%的甘露寡糖的添加量效果最好。有結(jié)果表明,在基礎飼料中添加一定量的果寡糖,能提高銀鯽(Carassius auratus)[18]和中華鱉(Trionyx sinensis)幼鱉[19]白細胞吞噬活性、血清溶菌酶活性、血清超氧化物歧化酶活性和血清補體C3的含量。上述研究結(jié)果均與本試驗結(jié)果一致。研究報道,功能性低聚糖可促進動物生長,提高飼料利用率[16-17,20],本試驗中添加不同水平的低聚木糖能不同程度的提高草魚的生長性能,也驗證了這一點。此外,本試驗中低聚木糖添加量為4 g/kg時的生長性能最佳,這與非特異性免疫功能提高的程度成正相關,說明低聚木糖通過提高魚體非特異性免疫功能來促進生長性能。

本研究結(jié)果還顯示,當?shù)途勰咎堑奶砑恿繛? g/kg時,各免疫指標活性較添加量為2、4 g/kg時有所下降,原因可能是過量的低聚木糖限制了腸道部分有益菌的增殖,從而影響了機體的免疫功能。當添加量為1 g/kg時,各項免疫指標活性與對照組差異不顯著,原因可能是添加量不足,起不到增加有益菌增殖的效果,進而無法達到增強機體免疫功能的作用。

4 結(jié) 論

飼料中添加低聚木糖可提高草魚非特異性免疫功能,其最佳添加量為4 g/kg。

[1] HSU C H,HW ANG S C,LIU JK.Succession of bacterial d rug resistance as an indicator of antibiotic app lication in aquaculture[J].Journal of the Fisheries Society of Taiw an,1992,19(11):55-64.

[2] LI J,Y IE J,FOO R W T,et al.Antibiotic resistance and plasm id profiles ofVibrioisolates from cultured silver sea bream,Sparus sarba[J].Marine Po llution Bu lletin,1999,39:245-249.

[3] 楊曙明.寡糖在動物營養(yǎng)研究中的進展[J].動物營養(yǎng)學報,1999,11(1):1-9.

[4] 洪豐,錢林,丁長河,等.低聚木糖分離純化技術的研究概述[J].農(nóng)產(chǎn)品加工學刊,2006(10):64-66.

[5] MAALEJ-ACHOURI I,GUERFALI M,GARGOURI A,et al.Production of xylo-oligosaccharides from agro-industrial residues using immobilizedTalarom yces thermophilusxy lanase[J].Journal of Molecular Catalysis B:Enzym atic,2009,59(1/3):145-152.

[6] PRADE R A.Xylanases:from biology to biotechno logy[J].Biotechnology and Genetic Engineering Reviews,1995,13(2):101-131.

[7] 周顯青,牛翠娟,孫儒泳.維生素C和E合用對中華鱉幼鱉非特異性免疫功能的影響[J].水生生物學報,2004,28(4):356-360.

[8] CHEN D,AINSWORTH A J.Glucan adm inistration potentiates immune de fence mechanisms of channel catfish,Lctalurus punctatusRafinesque[J].Journal of Fish Diseases,1992,15(4):295-304.

[9] DUN IER M,SIWICKI A K,DEMAELA A.Ef fec ts of organophosphorus insecticides:ef fects of trichlorfon and dichlorvos on the immune response of carp(Cyprinus carpio).Ⅲ.In vitroe ffects on lym phocy te p roliferation and phagocytosis andin vivoef fects on humoral response[J].Ecotoxicology and Environmental Safefy,1991,22:79-87.

[10] 李桂峰,錢沛鋒,孫際佳,等.維生素C對胡子鯰血清免疫相關酶活性的影響[J].大連水產(chǎn)學院學報,2004,19(4):301-305.

[11] 聶芬,石小濤,李大鵬,等.擁擠脅迫對史氏鱘稚魚血漿溶菌酶活性和補體水平的影響[J].水生生物學報,2007,31(4):581-584.

[12] ROBERFROID M B,VANLOO JA E,GBSON G R.The bifidogenic nature of chicory inulin and its hyd ro lysis products[J].Journal of Nutrition,1998,128:11-19.

[13] MOURA P,MARQUESS,ALVES L,etal.Effect of xylo-oligosaccharides from corn cobs autohydrolysis on the intestinalm icrobiota of piglets after w eaning[J].Livestock Science,2007,108(1):244-248.

[14] YOSH IDA T,KRUGER R,INGLIS V.Augention of nonspecific p rotection in African catfish,Clarias gariepinus(Burchell),by the long-term oral adm inistration of imm unostim ulants[J].Journal of Fish D iseases,1995(18):195-198.

[15] NEWMAN K.Mannan-o ligosaccharides:natural polym ers with significant impac ton the gast-rointestinalm icroflora and immune system[C]//LYONS T P,JACQUES K A.Biotechno logy in feed industry:p roceedings of A lltech's tenth annual sym posium.Nottingham:Nottingham University Press,1994:167-174.

[16] 劉愛君,冷向軍,李小勤,等.甘露寡糖對奧尼羅非魚(Oreochrom is niloticus×O.aureus)生長、腸道結(jié)構和非特異性免疫的影響[J].浙江大學學報:農(nóng)業(yè)與生命科學版,2009,35(3):329-336.

[17] 張紅梅.甘露寡聚糖對鯉魚生產(chǎn)性能及對鯉魚各項生化指標的影響[D].碩士學位論文.保定:河北農(nóng)業(yè)大學,2003.

[18] 王艷,吳志新,龐素風,等.果寡糖對銀鯽非特異性免疫功能的影響[J].水生生物學報,2008,32(4):488-492.

[19] 季高華,劉至治,冷向軍.飼料中添加 β-葡聚糖和低聚果糖對中華鱉幼鱉生長和血清SOD、溶菌酶活力的影響[J].上海水產(chǎn)大學學報,2004,3(1):36-41.

[20] 明建華,劉波,周群蘭,等.功能性寡糖在水產(chǎn)動物飼料中的應用[J].水產(chǎn)科學,2008,27(9):490-493.

*Correspond ing au thor,associate professor,E-mail:wuzhixin@m ail.hzau.edu.cn

(編輯 菅景穎)

Effectsof Xylo-oligosaccharides on Non-specific Immune Function of Grass Carp(Ctenopharyngodon idellus)

PANG Lijiao WU Zhixin*XIONG Juan ZHANG Peng YU Jianm in QU Yi HE Chaojun YANG Li CHEN Xiaoxuan

(College of Fisheries,Huazhong Agricultu ral University,Wuhan430070,China)

This experim ent was conducted to study the e ffects of xylo-o ligosaccharides on non-specific immune func tion of grass carp(Ctenopharyngodon idellus).Five hundred and tw enty-five healthy grass carp with basically the same size and body w eight were random ly assigned to 5 groupswith 3 replicates in each group and 35 fish in each replicate.G rass carp in 5 groupswere fed with the basal diets supplemented with 0(group A0),1(group A1),2(group A2),4(group A3)and 6 g/kg(group A4)xylo-oligosaccharides,respectively.The activities of blood leukocyte phagocytic,serum lysozym e,and serum superoxide dismutase,and the content of serum comp lement C3were determ ined on day 0,7,14,28 and 56,respectively.Calculating themortality after 14 d of challenge test when the culture experim ent(lasted for 56 d)w as finished.The results show ed that the immune indices of experimental groups were enhanced compared with the control group in the wholeexperiment.Among them,the leukocyte phagocy tic activity,serum lysozyme activity,serum superoxide dismutase activity and serum comp lement C3content in group A3were significantly higher than those in the controlgroup(P＜0.05),w hich reached to the top level on day 28,28,7,28 of the experiment,respec tive ly.The group A3also had the low estmortality rate among the 5 groups.These resu lts indicate that xylo-o ligosaccharides can enhance the non-specific immune function of grass carp,and the optimum addition level is 4 g/kg.[Chinese Journal of Anima l Nutrition,2010,22(6):1687-1693]

xylo-oligosaccharides;grass carp(Ctenopharyngodon idellus);non-specific imm une function

S963

A

1006-267X(2010)06-1687-07

10.3969/j.issn.1006-267x.2010.06.032

2010-06-23

國家科技支撐計劃項目(2007BAD 37B02);湖北省“十一五”科技攻關項目(2006AA 203A 02,2007AA 203A01)

龐麗姣(1985—),女,湖北孝感人,碩士研究生,研究方向為魚類營養(yǎng)與免疫。E-mail:plijiao16383@126.com

*通訊作者:吳志新,副教授,碩士生導師,E-mail:wuzhixin@m ail.hzau.edu.cn