硒對公豬精液品質(zhì)的影響及其機理

鐘 銘 吳 德* 方正鋒 車練強 林 燕

（1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動物營養(yǎng)研究所,雅安 625014;2.動物抗病營養(yǎng)教育部重點實驗室,雅安 625014）

公豬對群體的繁殖力有著重要的影響,然而在實際生產(chǎn)中卻是容易忽視的群體。在公豬的營養(yǎng)需要方面,M ark等[1]認為確定對精子發(fā)生有害或有益的“特殊營養(yǎng)因子”比確定公豬的飼糧營養(yǎng)需要更為重要。硒是動物機體必需的微量元素之一,在生物體內(nèi)參與重要的生理活動,是谷胱甘肽過氧化物酶的重要組成成分,能消除機體內(nèi)產(chǎn)生的自由基。對雄性動物的研究已發(fā)現(xiàn),動物體內(nèi)的代謝過程產(chǎn)生過多的自由基是導(dǎo)致動物不育的主要因素[2]。由此可見,硒與雄性動物的繁殖性能有著重要聯(lián)系。本文就硒對種公豬精液品質(zhì)影響及其機理研究進展做一綜述。

1 硒對公豬精液品質(zhì)的影響

Jacyno等[3]用不同形式的硒[亞硒酸鈉（Na2SeO3）和酵母硒]+維生素E飼糧飼喂70日齡的公豬,到180日齡時開始采精,測定其精液品質(zhì)。結(jié)果發(fā)現(xiàn),硒的添加形式和水平對精液體積沒有顯著影響,而含硒0.2 mg/kg的酵母硒組的精子密度、總數(shù)及滲透阻力（ORT）顯著高于含硒0.2 mg/kg的Na2SeO3組。Kolodziej等[4]發(fā)現(xiàn),含硒0.5 m g/kg的Na2SeO3組公豬的精液品質(zhì)較好,精漿中天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（AspAT）的活性最低,表明AspAT很少從精細胞滲到精漿中,精細胞膜受損較少。因此,硒對保證精子細胞膜的完整性有著重要作用。Segerson等[5]從公豬78日齡開始飼喂低硒飼糧,試驗組每14 d注射1次Na2SeO3（0.33mg/kg BW）,對照組每14 d注射1次同劑量生理鹽水,230日齡開始采精,發(fā)現(xiàn)注射硒制劑的公豬精液精子數(shù)比對照組高,但精子活力沒有顯著變化。然而,M arin-Guzman等[6-7]研究表明,硒對公豬精子活力和畸形率有著重要的影響。飼糧含硒0.5 mg/kg的Na2 SeO3組公豬精子中ATP濃度比未添加組高25%[6],精子活力、正常精子數(shù)分別是未添加組的1.46、2.56倍[7];同時公豬28日齡斷奶到18月齡期間飼糧添加硒更有利于精液品質(zhì)的提高。Fernandez等[8]也認為在0～0.5 mg/kg的硒添加范圍內(nèi),隨著飼糧中硒濃度的增加,精子活力和精子密度也隨之提高。M ahan[9]研究發(fā)現(xiàn),供給公豬強化硒飼糧,其正常精子率為62%,而低硒飼糧組的正常精子率僅為25%。M arin-Guzman等[6]觀察了硒缺乏組和0.5 m g/kg硒添加組公豬精子的超微結(jié)構(gòu),發(fā)現(xiàn)硒缺乏組精子尾部中段的線粒體呈橢圓形,排列松散,細胞膜部分破損,導(dǎo)致精子出現(xiàn)斷尾現(xiàn)象（圖1）。

母豬受孕率是反映精液品質(zhì)好壞最直觀的指標(biāo)。M arin-Guzman等[7]分別用來自低硒組、硒強化組公豬的精液使發(fā)情母豬受孕,受孕后5～7 d將其屠宰,發(fā)現(xiàn)低硒組游向卵母細胞的精子數(shù)量較少。這與Fernandez等[8]的報道一致。

圖1 公豬精子鞭毛中段縱向切片的電子顯微照片（90 K）Fig.1 Transm ission electron m icrographs（90 K）of longitudinal sec tions of flagellar m idpiece of boar spermatozoa

由以上的研究結(jié)果可以看出,硒對公豬精液品質(zhì)尤其在精子密度、精子活力、精子正常形態(tài)方面起著積極的作用。公豬飼糧中不適宜的硒添加水平,使得精子膜受損,尾部中段線粒體形態(tài)發(fā)生異常,導(dǎo)致ATP產(chǎn)生不足,繼而精子的運動受到影響,最終降低精子游向卵子、沖破卵膜的能量,無法完成正常的受精過程,導(dǎo)致母豬受孕率下降。

2 硒影響雄性動物精液品質(zhì)的機理

2.1 硒對雄性生殖激素的影響

梁明振等[10]的研究表明,精漿中的促卵泡生成素（FSH）、促黃體生成素（LH）和睪酮（T）濃度的變化受公豬飼糧含硒量的影響。當(dāng)硒添加量適宜時,硒的添加會促進上述3種激素的分泌,而當(dāng)硒添加量過多時,這3種激素的濃度又會降低。有報道指出,飼糧硒的水平可影響大鼠血清中的T濃度,缺硒時睪丸分泌的T量減少[11]。

然而對人的研究發(fā)現(xiàn),與攝入低劑量（每天攝入13μg）硒的男性相比,攝入高劑量（每天攝入297μg）硒的男性血漿中T、LH及FSH濃度無顯著變化,而血漿和精漿中前列腺素（PGF2α）的濃度顯著升高。血漿及精漿中的硒水平與飼糧中硒水平存在正相關(guān)關(guān)系,而精子中的硒水平不受飼糧中硒水平的影響[12-13]。精漿中的硒由附性腺的上皮細胞分泌,這暗示飼糧中硒水平的變化引起精液品質(zhì)的變化不依賴于下丘腦-垂體-睪丸性腺軸,而是通過影響附性腺組織對硒及激素的分泌來起作用。PGF2α可以促進雄性激素的分泌,Marin-Guzman等[14]在公豬上的試驗也發(fā)現(xiàn),硒能夠穩(wěn)定公豬前列腺和精囊腺中PGF2α的分泌。飼糧中添加硒可通過影響雄性激素的分泌來影響精液的品質(zhì)。目前,硒對雄性激素分泌的影響調(diào)控機制還不清楚,尚待進一步研究。

2.2 硒的抗氧化作用對精液品質(zhì)的影響

雄性動物精子細胞膜富含多不飽和脂肪酸,對脂質(zhì)過氧化反應(yīng)尤其敏感,此反應(yīng)可導(dǎo)致精子活力快速和不可逆喪失,進而使雄性動物繁殖性能降低[15]。飼糧中添加的硒經(jīng)十二指腸、空腸和回腸吸收后,大部分以硒半胱氨酸的形式參與到蛋白質(zhì)合成中,形成硒蛋白而發(fā)揮著生物學(xué)功能[16]。大部分硒蛋白具有抗氧化功能,其中較為重要的是谷胱甘肽過氧化物酶家族（GPx）。

Marin-Guzm an等[7]發(fā)現(xiàn)公豬精子、精漿、附睪、精囊腺、前列腺內(nèi)的GPx的活性、硒的濃度會隨著飼糧中硒的添加量增加而增加。但在未開始采精之前,睪丸中硒的濃度與GPx的活性沒有相關(guān)性。Jacyno等[3]報道飼糧中硒的添加并不影響血漿中硒濃度及GPx活性,但會使精漿中硒濃度增加,然而并不能增強精漿中GPx的活性。Lasota[17]的研究也沒有找到精漿中GPx活性與精液品質(zhì)之間的相關(guān)性,這可能與精漿中存在其他硒蛋白[如硒蛋白P（Sepp1）]有關(guān)。關(guān)于硒對公豬精漿脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的影響,Fernandez等[8]認為飼糧不同的硒添加水平（0.025、0.300、0.500 mg/kg）不影響精漿中丙二醛（MDA）的濃度。

然而對小鼠的研究發(fā)現(xiàn),隨著飼糧中硒添加量的升高,睪丸中硒的濃度增加,GPx的活性增加,并且GPx m RNA的表達水平也增加[18];但當(dāng)硒的添加量過高時,GPx的活性趨于穩(wěn)定[19]。Shalini等[20]報道,當(dāng)飼糧中硒缺乏或過量時,會使得小鼠睪丸中MDA、氧化性型谷胱甘肽（GSSG）的濃度增加,同時,附睪中精子染色體凝聚發(fā)生紊亂,DNA斷裂,精子畸形率升高（圖2）。這說明,飼糧中硒缺乏或過量都會使睪丸處于氧化應(yīng)激狀態(tài),加快脂質(zhì)過氧化反應(yīng),破壞精細胞膜,阻擾精子染色體凝聚,使得DNA暴露,易受活性氧族（ROS）的攻擊而發(fā)生斷裂,導(dǎo)致精子出現(xiàn)畸形。

圖2 小鼠附睪中精子吖啶橙染色結(jié)果（400×）Fig.2 A cridine orange staining o fm ice epididymal spermatozoa（400×）

2.3 硒對精子結(jié)構(gòu)成分磷脂氫谷胱甘肽過氧化物酶（GPx4）的影響

Calvin[21]在注射了75Se的大鼠中發(fā)現(xiàn),75Se聚集在精子的尾部中段,表明硒可能與精子的結(jié)構(gòu)組成有關(guān)。運用基質(zhì)輔助激光解吸電離質(zhì)譜技術(shù)（MA LDI-TOF）發(fā)現(xiàn)精子尾部中段線粒體微囊中近50%的結(jié)構(gòu)蛋白是無酶活的GPx4。GPx4在精子發(fā)育的早期具有酶活性,而在精子成熟期則聚合變構(gòu),轉(zhuǎn)變成一種結(jié)構(gòu)成分,維持精子的正常形態(tài)和活力[22]。動物攝入低硒飼糧,引起精子頭尾斷裂的現(xiàn)象可能與GPx4的生物合成量減少有關(guān)。父代雄鼠供給缺硒飼糧,其睪丸中GPx4的活性不受影響,然而后代雄鼠睪丸中GPx4的活性下降到僅為補硒組后代該酶活性的13%,暗示雄性動物對GPx4具有很強的儲存能力[23]。然而,Lei等[24]研究發(fā)現(xiàn),當(dāng)大鼠飼糧中的硒水平由2μg/kg上升到190μg/kg時,睪丸中GPx4的活性及其m RNA的表達水平不受飼糧硒水平的影響。同樣,Schriever等[25]報道,飼糧中硒的添加水平會顯著影響睪丸中細胞內(nèi)谷胱甘肽過氧化物酶（GPx1）的活性和GPx1、Sepp1以及硒蛋白W（Sepw1）m RNA的表達水平,而對GPx4的活性及其m RNA的表達無顯著影響。這提示,只有在動物體內(nèi)硒耗竭的情況下,睪丸中GPx4的活性才會受到影響,從而導(dǎo)致精子尾部線粒體結(jié)構(gòu)異常,頭尾斷裂。當(dāng)動物體內(nèi)具有一定的GPx4儲備時,飼糧中的硒可通過影響睪丸中GPx1、Sepp1、Sepw1的濃度,調(diào)節(jié)睪丸中的氧化應(yīng)激狀態(tài)以及硒的轉(zhuǎn)運水平,從而影響精液品質(zhì)。

2.4 硒與精子發(fā)生的關(guān)系

2.4.1 硒對精子發(fā)生的影響

在Marin-Guzm an等[14]的試驗中發(fā)現(xiàn),硒的添加對公豬不同發(fā)育階段精子生成的影響不同。在5.4或6.2月齡時,睪丸中精子總數(shù)不受飼糧中硒添加量的影響;在9.0月齡時,精子總數(shù)隨著硒的添加有上升趨勢;在18.0月齡時,補充硒可以獲得高的精子數(shù),且支持細胞、圓形精子細胞、次級精母細胞的數(shù)量較多。這說明硒有利于精子的生成,在整個發(fā)育階段,尤其在進入青春期后,硒的補充顯得尤為重要。同時,缺硒組精子頸部原生質(zhì)滴附著百分率比補硒組高。原生質(zhì)滴附著情況標(biāo)志著精子在附睪中的成熟度。飼糧中的硒影響著精子的發(fā)生和成熟,這可能與GPx4在精子發(fā)生中的作用有關(guān)。在精子整個發(fā)育過程中,GPx4最早出現(xiàn)在精母細胞粗線期的Ⅶ～Ⅹ階段,然后逐漸增加,在精子細胞延伸期達到分泌高峰[26]。因此,推測硒對精子發(fā)生的影響可能通過影響GPx4的合成過程來起作用,但該假設(shè)需要進一步證實。

2.4.2 硒對雄性生殖細胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子的影響

轉(zhuǎn)錄因子活化蛋白1（AP1）是一種復(fù)合轉(zhuǎn)錄因子,由同源或異源二聚體DNA結(jié)合蛋白組成,為典型的亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu),有Jun家族、Fos家族2個成員。AP1結(jié)合在一些與抗氧化防御、抗癌相關(guān)的基因的啟動子區(qū)域,如編碼γ-谷胱甘肽合成酶（γ-GCS）、從頭合成谷胱甘肽系統(tǒng)里的相關(guān)限速酶、超氧化物歧化酶、血紅素加氧酶等的基因。這些酶將會隨著AP1的變化而變化,從而改變細胞的抗氧化能力[18]。同時AP1對氧化反應(yīng)敏感,在生殖細胞增殖分化過程中起著重要的作用[27]。核轉(zhuǎn)錄因子-κB（NF-κB）與細胞的增殖分化過程有關(guān)[28],易被ROS激活,并且其激活過程受硒的調(diào)控[29]。

Shalini等[30]發(fā)現(xiàn),適宜硒添加量組小鼠的早期有絲分裂的精原細胞和精母細胞內(nèi)cjun和cfos的m RNA表達水平較高,在減數(shù)分裂時有所降低,而在精細胞延伸和成熟時表達水平達到頂峰。而硒的缺乏將會導(dǎo)致睪丸生殖細胞中的cjun和cfos的m RNA表達水平降低,從而減少生殖細胞的數(shù)量,降低生育能力。為了探究硒對AP1、NF-κB表達的不同調(diào)節(jié)機制,Shalini等[31]將小鼠睪丸細胞在體外培養(yǎng),以0.5、1.5μm ol/L的量單獨添加亞硒酸鹽或同BSO（10 nmol/L,一種谷胱甘肽耗竭劑）一起添加,檢測了還原性谷胱甘肽（GSH）、GSSG的活性及細胞內(nèi)γ-GCS、cjun和cfos的mRNA表達水平,結(jié)果發(fā)現(xiàn)硒對cjun和cfos的影響是不同的。在氧化應(yīng)激反應(yīng)較緩慢的情況下,cjun和cfos的基因表達增強,而在硒過量或GSH耗竭的情況下,ROS的聚集誘發(fā)p65（NF-κB的亞基）的表達。AP1的表達通常與細胞增殖分化有關(guān),有利于精子的生成。而NF-κB基因的激活,將會使細胞凋亡。由此可見,硒可通過影響雄性生殖細胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子的表達而調(diào)控精子的發(fā)生過程。

2.4.3 硒對雄性生殖細胞內(nèi)細胞分裂周期蛋白的影響

硒缺乏和過量時,會影響細胞內(nèi)的氧化還原狀態(tài),而氧化應(yīng)激與生殖細胞凋亡有一定聯(lián)系。在整個細胞分裂過程中,驅(qū)使細胞進入分裂中期的過程由CDC2和Cyclin B1形成的異源二聚體所調(diào)控[32]。在雄性配子形成時,這些蛋白質(zhì)在減數(shù)分裂的過程中起著關(guān)鍵作用。任一蛋白質(zhì)的鈍化或合成中斷,都會擾亂細胞分裂過程,促使生殖細胞凋亡[33]。K aushal等[32]研究發(fā)現(xiàn)脂質(zhì)過氧化反應(yīng)在硒過量和缺乏時都加強,而CDC2、Cyclin B1、Cdc25c的表達顯著減少,p21蛋白（一種激酶抑制劑）的表達顯著提高。因此,在硒缺乏和過量產(chǎn)生的氧化應(yīng)激下,通過控制Cdc25c、p21蛋白的表達,使CDC2/Cyclin B1復(fù)合物下調(diào),導(dǎo)致細胞周期停滯。這從新的角度解釋了由硒缺乏和過量產(chǎn)生的氧化應(yīng)激最終導(dǎo)致精子數(shù)量減少的原因。

3 硒在公豬生產(chǎn)中的運用

公豬飼糧中硒的缺乏和過量都會對精液品質(zhì)造成不良影響。通過總結(jié)部分研究（表1）發(fā)現(xiàn),種公豬斷奶后,飼糧中硒的適宜添加量在0.3 mg/kg左右,有機硒的添加量低于無機硒。在夏季熱應(yīng)激及采精頻率較高時,可適當(dāng)提高硒的添加量[34]。硒具有一定毒性,NRC（1998）給出的硒的毒性劑量為5.0mg/kg。有機硒低毒高效,是較理想的硒源,開發(fā)更為經(jīng)濟的有機硒源成為目前的熱點。

表1 公豬飼糧中硒的適宜添加量Tab le 1 Optim al supplemental levels o f selenium in boars'diet

4 結(jié) 語

公豬飼糧中的硒水平在決定精液品質(zhì)好壞方面起著重要作用。硒影響著雄性動物生殖激素的分泌,并維持著精細胞內(nèi)的氧化還原狀態(tài),同時參與精子中段結(jié)構(gòu)的構(gòu)建,調(diào)控著精子發(fā)生過程。硒影響雄性動物精液品質(zhì)的機理已從表觀現(xiàn)象進入到蛋白質(zhì)分子水平。為保證較佳的精液品質(zhì),建議種公豬斷奶后飼糧中硒添加量為0.3 mg/kg。

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*Correspond ing au thor,p rofessor,E-m ail:pig2pig@sina.com

（編輯 菅景穎）