何首烏飲對(duì)衰老雄性大鼠睪丸生殖功能的影響*

郭凱華，高福祿，牛嗣云，陳 龍

（承德醫(yī)學(xué)院，河北承德 067000）

隨著衰老，睪丸的結(jié)構(gòu)和功能會(huì)出現(xiàn)不同程度的減退，精子生成能力減弱、血清睪酮水平降低[1-2]。睪酮可促進(jìn)睪丸生精功能，維持性腺的正常結(jié)構(gòu)與功能；睪丸局部調(diào)節(jié)因子IGF-1對(duì)精子發(fā)生也具有調(diào)節(jié)作用。何首烏飲由《宣明論方》何首烏丸加味而成，具有補(bǔ)肝腎、益精血、延年益壽之功效。本研究給予衰老模型大鼠何首烏飲灌胃，探討其對(duì)衰老雄性大鼠生殖功能的影響。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑 D-半乳糖，北京化學(xué)試劑公司；放射免疫試劑盒，北京北方生物技術(shù)研究所；IGF-1 mRNA原位雜交試劑盒，天津?yàn)笊镏破房萍加邢薰尽?/p>

何首烏飲方劑組成：何首烏、肉蓯蓉、懷牛膝、淫羊霍、丹參、茯苓，按質(zhì)量比3:2:3:2:5:3混合，熬制后含生藥為9.6g/ml，4℃保存，給藥前復(fù)溫至25-30℃。何首烏丸方劑組成：何首烏、肉蓯蓉、懷牛膝，按質(zhì)量比3:2:3混合，熬制后含生藥2.06g/ml，4℃保存，給藥前復(fù)溫至25-30℃。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及建立衰老模型 8周齡清潔級(jí)SD雄性大鼠32只，由河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，體重180-220g。將大鼠隨機(jī)分為正常組、模型組、何首烏飲組和何首烏丸組，每組8只大鼠。模型組、何首烏飲組和何首烏丸組大鼠均采用6%D-半乳糖（300mg/kg/d，60d）連續(xù)腹腔注射建立亞急性衰老動(dòng)物模型。造模成功后，模型組大鼠不再做處理，何首烏飲組和何首烏丸組大鼠分別給予何首烏飲（38.4g/kg/d）和何首烏丸（8.24g/kg/d）灌胃60天。

1.3 檢測血清睪酮濃度 各組大鼠灌胃結(jié)束后，10%水合氯醛腹腔注射麻醉，經(jīng)內(nèi)眥取血，離心取上清，采用放射免疫法檢測血清睪酮濃度。

1.4 精子計(jì)數(shù)，觀察精子活動(dòng)度和存活率 各組大鼠取血后，取一側(cè)附睪頭放入盛有5ml生理鹽水并于37℃水浴中預(yù)熱的小培養(yǎng)皿中，剪碎成精子懸液，37℃水浴靜置20min，取0.1ml滴于37℃預(yù)熱的血細(xì)胞計(jì)數(shù)板上，光鏡下迅速觀察，記錄200個(gè)精子，計(jì)算精子活動(dòng)度，精子計(jì)數(shù)按紅細(xì)胞計(jì)數(shù)法。取精子懸液1ml，0.4%臺(tái)盼蘭0.1ml染色，光鏡觀察，計(jì)算100個(gè)精子中活精子的比例。

1.5 睪丸IGF-1 mRNA表達(dá)的檢測及定量分析 大鼠取附睪后，4%多聚甲醛灌流固定，取雙側(cè)睪丸，入含1：1000 DEPC的4%多聚甲醛中固定2h，常規(guī)石蠟包埋，Leica石蠟切片機(jī)連續(xù)切片，片厚7μm。采用原位雜交方法觀察睪丸IGF-1 mRNA的表達(dá)，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，常規(guī)脫水、透明，中性樹膠封片。陰性對(duì)照用PBS代替一抗。IGF-1雜交探針序列：上游引物5'-GTCGTCTTCACATCTCTTCTACCTGGCACTC-3'，下游引物5'-GAGAGCCAGGTAGAAGAGATGTGAAGACGAC-3'。

采用MiVnt圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行定量分析，每個(gè)標(biāo)本檢查3張切片，每張切片在10×40倍顯微鏡下檢查10個(gè)視野，計(jì)數(shù)每個(gè)視野IGF-1 mRNA陽性細(xì)胞數(shù)和陰性細(xì)胞數(shù)，計(jì)算免疫陽性細(xì)胞數(shù)占細(xì)胞總數(shù)的百分比。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析 采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用q檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 大鼠血清睪酮濃度 見附表。模型組大鼠血清睪酮濃度明顯下降，與正常組比較差異顯著（P＜0.05）；何首烏飲組大鼠血清睪酮濃度明顯高于何首烏丸組和模型組（P＜0.05）。

2.2 大鼠附睪頭精子計(jì)數(shù)、精子存活率和活動(dòng)度 見附表。模型組大鼠精子數(shù)量、存活率和活動(dòng)度均明顯低于正常組（P＜0.05）；何首烏飲組大鼠精子數(shù)量、存活率和活動(dòng)度明顯高于何首烏丸組和模型組（P＜0.05）。

2.3 大鼠睪丸IGF-1 mRNA的表達(dá) IGF-1 mRNA陽性產(chǎn)物位于睪丸間質(zhì)細(xì)胞、支持細(xì)胞和精母細(xì)胞胞漿，呈棕黃色彌散顆粒狀（附圖）。定量分析結(jié)果見附表：模型組大鼠睪丸IGF-1 mRNA的表達(dá)明顯低于正常組（P＜0.05）；何首烏飲組大鼠睪丸IGF-1 mRNA的表達(dá)明顯高于何首烏丸組和模型組（P＜0.05）。

附表 大鼠各指標(biāo)檢測結(jié)果（±s）

附表 大鼠各指標(biāo)檢測結(jié)果（±s）

與正常組比較：*P＜0.05；與模型組比較：#P＜0.05；與何首烏飲組比較：▲P＜0.05

組別 精子相關(guān)指標(biāo)（n=8） 睪酮IGF-1 mRNA數(shù)量（106/ml）存活率（%）活動(dòng)度（%）（ng/ml，n=8） （%）正常對(duì)照組4.62±0.4790.4±4.3181.04±9.954.65±1.1612.42±0.38模型組2.60±0.46*▲46.99±4.73*▲44.8±6.21*▲0.99±0.35*▲ 2.56±0.4*▲何首烏飲組4.45±1.58#78.8±6.65#74.35±9.47#4.01±0.89# 8.99±2.34#何首烏丸組4.11±1.34#65.23±4.36#▲61.33±6.31#▲2.16±1.13*#▲ 5.92±1.01*#▲

圖 大鼠睪丸IGF-1 mRNA原位雜交染色（×400）：1-正常組，2-模型組，3-何首烏丸組，4-何首烏飲組

3 討論

D-半乳糖致衰老模型表現(xiàn)出與人類自然衰老相似的一系列生理生化改變，是目前延緩衰老實(shí)驗(yàn)研究應(yīng)用最多的動(dòng)物模型之一。衰老是機(jī)體正常的生理現(xiàn)象，隨著年齡增長，睪丸呈現(xiàn)退行性變，影響睪酮的分泌和生殖功能。睪丸的生殖功能不僅受下丘腦-垂體-性腺軸的調(diào)節(jié)，同時(shí)也受睪丸局部調(diào)節(jié)因子的影響。

睪酮是啟動(dòng)和維持精子發(fā)生的重要激素，臨床上常用睪酮水平判斷睪丸的生精功能。睪酮主要通過與支持細(xì)胞分泌的雄激素結(jié)合蛋白結(jié)合維持它在生精小管內(nèi)的高濃度，為生精細(xì)胞的分化提供適宜的內(nèi)環(huán)境。Atantssova等對(duì)精子發(fā)生時(shí)減數(shù)分裂各個(gè)時(shí)期的觀察顯示[3]，睪酮能直接或間接促進(jìn)生精細(xì)胞的發(fā)生和發(fā)育，抑制生精細(xì)胞凋亡。Chen等報(bào)道[4]，在下丘腦、垂體衰老變化的共同作用下，老年男性睪丸間質(zhì)細(xì)胞功能降低，使睪酮合成和分泌能力下降，導(dǎo)致老年人血清睪酮水平降低。Henkel等發(fā)現(xiàn)[5]，附睪精子成熟和精子活動(dòng)力的誘導(dǎo)均需有生物活性的睪酮的作用，因此精子活動(dòng)力下降可能與血清睪酮水平降低有關(guān)。睪丸間質(zhì)細(xì)胞、支持細(xì)胞可分泌多種因子，如EGF、IGF-1等，它們對(duì)精子發(fā)生均具有調(diào)節(jié)作用。缺乏IGF-1的小鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞類固醇激素合成酶基因表達(dá)水平降低，導(dǎo)致間質(zhì)細(xì)胞不能成熟[6]。免疫學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，睪丸支持細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞存在IGF-1受體，IGF-1可刺激增強(qiáng)睪丸間質(zhì)細(xì)胞甾體生成和支持細(xì)胞轉(zhuǎn)鐵蛋白的生成[6]。

傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)認(rèn)為腎中精氣的盛衰決定衰老的速度，延年益壽中藥均屬補(bǔ)腎類藥。何首烏丸由何首烏、肉蓯蓉、懷牛膝組成，能填精補(bǔ)髓、烏發(fā)延年。何首烏飲于此基礎(chǔ)上加淫羊藿補(bǔ)腎壯陽以強(qiáng)筋骨，丹參活血化瘀以通心脈，茯苓健脾利濕以寧心神，諸藥相配通調(diào)心脾肝腎四臟，而以腎為主。本研究結(jié)果顯示，何首烏飲可以提高衰老大鼠精子數(shù)量、活動(dòng)度和存活率，提高衰老大鼠血清睪酮濃度、上調(diào)睪丸IGF-1mRNA的表達(dá)；表明何首烏飲可調(diào)節(jié)雄性大鼠睪丸分泌睪酮的功能，通過提高局部調(diào)節(jié)因子IGF-1 mRNA的表達(dá)，改善睪丸的生殖功能，從而延緩性腺衰老。

[1]Kaufman JM, Vermeulen A. The decline of androgen levels in elderly men and its clinical and therapeutic implications[J]. Endocr Rev, 2005, 26（6）:833-876.

[2]Andersson AM, Jensen TK, Juul A, et al. Secular decline in male testosterone and sex hormone binding globulin serum levels in Danish population surveys[J]. J Clin Endocrinol Metab, 2007, 92 （12）:4696-4705.

[3]Atanassova N, Koeva Y, Bakalska M, et al. Loss and recovery of androgen receptor protein expression in the adult rat testis following androgen withdrawal by ethane dimethanesulfonate[J].Folia Histochem Cytobiol, 2006,44（2）:81-86.

[4]Chen H, Hardy MP, Huhtaniemi I, et al. Age-related decreased Leydig cell testosterone production in the brown Norway rat[J]. J Androl, 1994, 15（6）:551-557.

[5]Henkel R, Maass G, Schuppe HC, et al. Molecular aspects of declining sperm motility in older men[J]. Fertil Steril, 2005, 84（5）:1430-1437.

[6]Wang GM, O'Shaughnessy PJ, Chubb C, et al. Effects of insulin-like growth factor I on steroidogenic enzyme expression levels in mouse leydig cells[J]. Endocrinology,2003, 144（11）:5058-5064.