TGF-β1對(duì)絨癌JEG-3細(xì)胞MMP-9 mRNA表達(dá)的影響*

李曉茹，李玉紅，許 倩

（承德醫(yī)學(xué)院，河北承德 067000）

胎盤(pán)來(lái)源的滋養(yǎng)細(xì)胞具有與腫瘤細(xì)胞相似的侵襲性，其侵襲力增強(qiáng)會(huì)導(dǎo)致高度惡性的絨毛膜癌。目前，大量研究證實(shí)基質(zhì)金屬蛋白酶-9（MMP-9）是參與人滋養(yǎng)細(xì)胞侵入子宮內(nèi)膜的主要蛋白酶，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1（TGF-β1）可調(diào)節(jié)MMP-9的表達(dá)和活性。本實(shí)驗(yàn)以絨癌JEG-3細(xì)胞為研究對(duì)象，觀(guān)察外源性TGF-β1在不同作用時(shí)間對(duì)絨癌JEG-3細(xì)胞MMP-9 mRNA表達(dá)的影響，探討絨癌侵襲轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞來(lái)源 人絨癌細(xì)胞系JEG-3，由中國(guó)科學(xué)院動(dòng)物研究所計(jì)劃生育及生殖生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 試劑 TGF-β1，PEPROTECH；胎牛血清，天津?yàn)蠊?；DMEM，GIBCO BRL；Trizol總RNA提取試劑，博大泰克；通用型RT-PCR試劑盒，大連寶生物；引物及內(nèi)參，上海生工；DNA Marker DL2000，大連寶生物。

1.3 JEG-3細(xì)胞總RNA的提取 取指數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，常規(guī)消化，以1×105/ml的濃度接種于6孔板，培養(yǎng)48h后無(wú)血清培養(yǎng)24h以使細(xì)胞達(dá)到同步化。同步化后加入TGF-β1，應(yīng)用濃度為100ng/ml，然后分別培養(yǎng)0h、12h、24h、48h和72h。按試劑盒說(shuō)明操作提取細(xì)胞總RNA，以DEPC水溶解，測(cè)定260/280nm吸光度比值，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)顯示所提RNA是否完整。

1.4 RT-PCR法檢測(cè)MMP-9 mRNA的表達(dá) 按通用型RT-PCR試劑盒說(shuō)明操作。MMP-9上游引物（5’-3’）：TCG TGC CTC TGC CCA TAG G，下游引物（5’-3’）：CAC CCT TGT GCT CTT CCC TG，擴(kuò)增產(chǎn)物462bp；β-actin上游引物（5’-3’）：AGC GGG AAA TCG TGC GTG AC，下游引物（5’-3’）：ACA TCT GCT GGA AGG TGG AC，擴(kuò)增產(chǎn)物453bp。cDNA的合成：30℃、10min，42℃、30min，99℃、5min，5℃、5min。PCR擴(kuò)增MMP-9：94℃、2min，94℃、30sec，57℃、30sec，72℃、1min，30個(gè)循環(huán)；PCR擴(kuò)增β-actin：94℃、2min，94℃、30sec，58℃、30sec，72℃、1min，30個(gè)循環(huán)。產(chǎn)物于2%瓊脂糖凝膠電泳，恒壓120V，30min，UVP成像分析系統(tǒng)拍照觀(guān)察。

1.5 數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計(jì)分析 采用Quantity One軟件對(duì)圖像進(jìn)行灰度分析，每組實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)4次。以目的基因條帶與β-actin基因條帶的灰度比值作為MMP-9 mRNA的相對(duì)表達(dá)水平，數(shù)據(jù)以（±s）表示，采用SPSS 11.5統(tǒng)計(jì)軟件，組間資料比較采用方差分析。

2 結(jié)果

TGF-β1作用0h、12h、24h、48h和72h，JEG-3細(xì)胞MMP-9 mRNA的相對(duì)表達(dá)水平分別為：（0.21±0.01）、（0.26±0.01）、（0.30±0.01）、（0.45±0.01）和（0.66±0.02）；隨TGF-β1作用時(shí)間的延長(zhǎng)，絨癌JEG-3細(xì)胞MMP-9 mRNA的表達(dá)逐漸增加，差異具有顯著性（P＜0.01）。圖1-2。

圖1 JEG-3細(xì)胞β-actin mRNA的表達(dá)

圖2 JEG-3細(xì)胞MMP-9 mRNA的表達(dá)

3 討論

基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）是一族鋅依賴(lài)性?xún)?nèi)肽酶，幾乎可以降解細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）的所有成分，在腫瘤的侵襲、生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移等生物學(xué)行為中起著至關(guān)重要的作用[1]。TGF-β超家族是由多種具有共同生物學(xué)特性的細(xì)胞因子所組成的大家族，可影響MMPs的分泌和活性[2]。

MMPs是降解ECM最重要的酶，大量研究證實(shí)MMPs與腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。膀胱移行癌組織中MMP-2及MMP-9 mRNA的水平明顯高于正常膀胱組織，且隨腫瘤分級(jí)的增高，表達(dá)逐漸增強(qiáng)[3]。肺癌組織中MMP-2、MMP-9 的表達(dá)水平顯著高于癌旁肺組織和肺良性病變肺組織[4]。Tee等[5]利用KAⅡ/CD82抑制H1299人非小細(xì)胞癌細(xì)胞株MMP-9 mRNA的表達(dá)后，癌細(xì)胞的侵襲與轉(zhuǎn)移顯著降低。因此推測(cè)，MMP-9的表達(dá)與腫瘤的浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，可能正是MMP-9對(duì)ECM的過(guò)度降解導(dǎo)致癌細(xì)胞離開(kāi)原發(fā)灶向遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，使腫瘤細(xì)胞有更大的增殖浸潤(rùn)空間，加劇惡性化進(jìn)展。正常表達(dá)的MMP-9基因可調(diào)控和維持正常組織功能，但在滋養(yǎng)細(xì)胞疾病中，各種因素導(dǎo)致MMP-9分泌和活性異常，使其正常調(diào)控作用消失，導(dǎo)致滋養(yǎng)細(xì)胞侵入子宮內(nèi)膜的深度異常。

本實(shí)驗(yàn)采用濃度為100ng/ml的TGF-β1作用絨癌JEG-3細(xì)胞，分別于作用后0h、12h、24h、48h和72h收獲細(xì)胞，采用RT-PCR技術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞MMP-9 mRNA的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)JEG-3細(xì)胞對(duì)TGF-β1有良好的反應(yīng)性，且隨TGF-β1作用時(shí)間的延長(zhǎng)，MMP-9 mRNA的表達(dá)逐漸增加。有研究表明，TGF-β1對(duì)腫瘤的作用表現(xiàn)為雙重性，在腫瘤發(fā)生的早期，TGF-β1表現(xiàn)為抑制效應(yīng)，隨著腫瘤的發(fā)展逐漸演變?yōu)檎越橘|(zhì)。Kamakar等[6]通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，TGF-β1可抑制MMP-9的活性和表達(dá)，從而抑制滋養(yǎng)細(xì)胞的過(guò)度浸潤(rùn)侵襲，表明對(duì)于正常滋養(yǎng)細(xì)胞，TGF-β1可負(fù)向調(diào)控MMP-9的表達(dá)。但對(duì)絨癌JAR細(xì)胞系的研究發(fā)現(xiàn)，在一定濃度范圍內(nèi)，MMP-9基因的表達(dá)隨著TGF-β1濃度的增加而增高[7]。本實(shí)驗(yàn)的研究對(duì)象為永生化腫瘤細(xì)胞系，推測(cè)此時(shí)可能TGF-β1已成為腫瘤刺激因子，原本對(duì)MMP-9分泌的抑制作用變成了促進(jìn)作用，導(dǎo)致MMP-9大量表達(dá)，促進(jìn)了絨癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。MMPs與滋養(yǎng)細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，可能作為絨癌早期侵犯的指標(biāo)，進(jìn)一步的深入研究將為絨癌的積極治療提供理論依據(jù)。

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