拮抗微生物誘導采后果蔬抗病性的機制

羅 楊，明 建,2，曾凱芳,2,*

(1.西南大學食品科學學院，重慶 400715；2.重慶市特色食品工程技術(shù)研究中心，重慶 400715)

拮抗微生物誘導采后果蔬抗病性的機制

羅 楊1，明 建1,2，曾凱芳1,2,*

(1.西南大學食品科學學院，重慶 400715；2.重慶市特色食品工程技術(shù)研究中心，重慶 400715)

綜述拮抗微生物誘導采后果蔬抗病性的機制。拮抗微生物能夠誘導果蔬產(chǎn)生植物保衛(wèi)素，提高果蔬防御酶如幾丁質(zhì)酶、β-1,3-葡聚糖酶、苯丙氨酸解氨酶、過氧化物酶和多酚氧化酶的活性，并能夠通過調(diào)節(jié)活性氧代謝和提高果蔬結(jié)構(gòu)抗性，從而增強果蔬的抗病性。拮抗微生物誘導采后果蔬抗病性的機制研究將為生物防治技術(shù)在采后果蔬病害防治中的應(yīng)用提供參考依據(jù)。

生物防治； 拮抗微生物； 采后病害； 誘導抗病性機制

化學殺菌劑對環(huán)境和農(nóng)產(chǎn)品的污染直接影響人類的健康，已成為當今公眾所關(guān)注的主要問題之一。為了保證農(nóng)產(chǎn)品的衛(wèi)生和安全，世界各國都在探索能代替化學農(nóng)藥的防腐保鮮新技術(shù)。采后生物防治作為21世紀七八十年代迅速發(fā)展起來的控制采后果蔬病害的新技術(shù)，在國內(nèi)外已得到了廣泛的研究[1-2]，并且在歐美一些發(fā)達國家得到商業(yè)化運用[3]。拮抗微生物不僅能作為生物防治劑直接與病原菌作用控制真菌病害的發(fā)生，更能作為自然抗病性的激發(fā)子，誘導果蔬自身的系統(tǒng)抗性，提高果蔬免疫力，延長果蔬保鮮期。因此，利用拮抗微生物誘導采后果蔬抗病性為果蔬產(chǎn)品采后病害防治開辟了一條安全環(huán)保的途徑。

目前很多研究都致力于拮抗微生物誘導植物抗病機制的研究，但對于采后果蔬生物防治機制的研究相對滯后，目前有關(guān)拮抗微生物誘導采后果蔬抗病性機制的研究主要從以下幾方面進行探討。

1 誘導產(chǎn)生植物保衛(wèi)素

植物保衛(wèi)素(phyto alexin，PA)是植物在被各種微生物、化學物質(zhì)或機械傷害刺激下合成積累的一類具有抗菌活性的低分子質(zhì)量脂溶性化合物，主要是異黃酮類和萜類物質(zhì)，隨著采后果蔬的成熟或貯藏期的延長，PA積累能力逐步下降，感病性也逐步增加。很多拮抗微生物可以誘導果實產(chǎn)生PA。Arras等[4-5]將無名假絲酵母(Candida famata)作用于柑橘果實后發(fā)現(xiàn)這種拮抗菌可以誘導柑橘產(chǎn)生植保素和7-羥基-6-甲氧基香豆素(scopoletin)等抗性物質(zhì)；將季也蒙畢赤酵母(Pichia guilliermondii)接種柑橘果實后，柑橘傷口組織合成PA

蒿屬香豆素(scoparone)和東莨菪苷原(scopoletin)。Droby等[6]在研究假絲酵母(Candida oleophila)對葡萄采后青霉菌的拮抗作用時發(fā)現(xiàn)，向葡萄果皮組織上添加假絲酵母細胞懸浮液可誘導PA的積累。果實中積累的PA常常是通過結(jié)合果實在受到侵染或激發(fā)后產(chǎn)生的結(jié)構(gòu)變化(如乳突、木質(zhì)層等)對病原菌的生長和擴散進行抑制。

2 誘導產(chǎn)生防御酶

果蔬在受到病原生物或各種逆境因子作用后，誘導產(chǎn)生一類可直接或間接抑制病原微生物生長、提高果蔬自然抗病能力的蛋白質(zhì)，稱為防御酶。它們的防御機制主要是指直接抑制或殺死病原菌、參與抗性物質(zhì)合成以及調(diào)節(jié)果蔬體內(nèi)活性氧代謝等方面。這類酶的基因表達量在果蔬正常生長過程中很低，但在果蔬遭受病原生物或逆境因子誘導后可大量表達[7]。

2.1 胞外水解酶

幾丁質(zhì)酶(chintinase)和β-1,3-葡聚糖酶(β-1,3-g l uc a n a se)是廣泛存在于果蔬體內(nèi)的病程相關(guān)蛋白(pathogenesis related proteins，PRP/PRs)的典型代表。由于病原真菌的細胞壁主要成分為幾丁質(zhì)和β-1,3-葡聚糖，這兩種胞外水解酶可通過降解真菌細胞壁組分，使原生質(zhì)膜破裂而直接殺死病原菌，達到保護寄主的作用[8]。二者在降解真菌細胞壁反應(yīng)中呈現(xiàn)協(xié)同作用，并且二者活性會隨著果蔬貯藏時間的變化而變化，從而影響果蔬的抗病能力[9]。研究表明，拮抗微生物可提高果蔬體內(nèi)這兩種胞外水解酶的活性。Ippolito等[10]發(fā)現(xiàn)出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)應(yīng)用于蘋果上可以顯著誘導提高蘋果果實的幾丁酶、β-1,3-葡聚糖酶和過氧化物酶的活性。D r o b y等[6]將假絲酵母(C a n d i d a oleophila)作用于采后葡萄時也發(fā)現(xiàn)，葡萄果實中的幾丁質(zhì)酶和β-1,3-葡聚糖酶活性有明顯增高。田世平等[11]的研究表明季也蒙假絲酵母(Candida guiliermondii)和膜醭畢赤酵母(Pichia membranefacien)可以誘導桃果實產(chǎn)生較高水平的幾丁質(zhì)酶和β-1,3-葡聚糖酶活性，增強對桃子軟腐病的抑制效果；阿比達斯隱球酵母(Cryptococcus albidus)也可誘導提高果實幾丁質(zhì)酶和β-1,3-葡聚糖酶活性，尤其是幾丁質(zhì)酶的活性，明顯高于對照和膜醭畢赤酵母處理組[12]。

2.2 抗性物質(zhì)合成酶

果蔬體內(nèi)的抗性物質(zhì)主要是木質(zhì)素、酚類物質(zhì)以及P A之類，果蔬體內(nèi)許多防御酶如苯丙氨酸解氨酶(phenylalanine am monia-lyase，PAL)、過氧化物酶(peroxidase，POD)及多酚氧化酶(polyphenol oxidase，PPO)等都有參與或催化抗性物質(zhì)合成的作用。PAL作為果蔬丙烷類代謝途徑的關(guān)鍵酶和限速酶，被認為是與果蔬抗病反應(yīng)密切相關(guān)的酶類，它通過專一催化由莽草酸途徑產(chǎn)生的L-苯丙氨酸，經(jīng)歷苯丙烷代謝途徑，產(chǎn)生一系列如黃酮體、木質(zhì)素、生物堿等與果蔬抗性相關(guān)的苯丙烷類化合物。Wisniewski等[13]在研究拮抗酵母菌P.guilliermondii誘導蘋果、桃、柑桔抗病性時發(fā)現(xiàn)果實經(jīng)拮抗菌處理后其PAL活性明顯提高。

POD和PPO也是果蔬體內(nèi)十分重要的抗性物質(zhì)催化合成酶，它們在果蔬體內(nèi)不僅參與乳突中酚類物質(zhì)的聚合和氧化反應(yīng)，還促進木質(zhì)素和PA的合成[14]。研究表明果蔬產(chǎn)品的這些與抗性相關(guān)物質(zhì)合成有關(guān)的防御酶類活性可由拮抗菌誘導提高。接種枯草芽孢桿菌(Bacillus subtitle)能明顯減輕蘋果果實炭疽病的發(fā)生，誘導蘋果果實中POD和PPO活性的升高[15]。采后桃果實上接種拮抗酵母菌P.Membranefaciens后PPO、 POD、PAL活性都有所升高[16]。王博等[17]在研究檸檬形克勒克酵母對溫州蜜柑“國慶一號”采后貯藏的防腐效果時也發(fā)現(xiàn)拮抗酵母菌懸液對蜜柑的過氧化物酶(POD)活性有誘導提高的作用。羅倫隱球酵母(Cryptococcus laurentii)作用于梨果實也能顯著增高果實的POD活性，延長梨果實的貯藏期[18]。

3 調(diào)節(jié)活性氧代謝

果蔬受到病原菌侵染或逆境因子等生物或非生物因素脅迫時，細胞內(nèi)會急劇產(chǎn)生大量的活性氧，這時必須依靠體內(nèi)活性氧清除系統(tǒng)使活性氧含量始終處于動態(tài)平衡的狀態(tài)。拮抗微生物可通過誘導提高果蔬體內(nèi)活性氧代謝相關(guān)酶類的活性進而調(diào)節(jié)果蔬的抗病反應(yīng)。其中，POD、超氧化物歧化酶(superoxide d ismutase，SOD)以及過氧化氫酶(catalase，CAT)在清除活性氧、阻止活性氧的形成等方面起著重要作用[19]。當這些活性氧相關(guān)酶的活性受到來自果蔬自身內(nèi)源激發(fā)子或外來非生物或生物激發(fā)子(包括拮抗菌)的誘導而提高時，果蔬的抗病能力也隨之提高。有研究表明，經(jīng)拮抗菌發(fā)酵液處理的柑橘果實的霉變率明顯低于對照組，進一步測定結(jié)果表明，經(jīng)拮抗細菌和酵母菌處理后柑橘果實的POD及SOD的活性在各測定時間段都比對照組高[20]。研究膜醭畢赤酵母(Pichia membranefacien)對采后番茄果實病害的防治效果時也發(fā)現(xiàn)果實的SOD、CAT活性在經(jīng)拮抗菌處理后有明顯升高，同時拮抗菌懸液處理組果實的發(fā)病率與病斑直徑均小于對照果實[21]。

4 誘導產(chǎn)生結(jié)構(gòu)抗性

采后果蔬在受到外來拮抗微生物激發(fā)子的誘導后會發(fā)生細胞組織結(jié)構(gòu)的變化，形成一些可以阻止病原菌入侵的特殊結(jié)構(gòu)來保護自身。Wilson等[22]在觀察蘋果傷口處酵母菌C.saitoana和B.cinerea作用的超微結(jié)構(gòu)時發(fā)

現(xiàn)，酵母細胞不僅能防止病原菌菌絲對寄主細胞的降解，還能使病菌菌絲腫脹變形，并誘導寄主細胞產(chǎn)生乳突狀結(jié)構(gòu)，封填細胞內(nèi)部空間以阻止真菌入侵。另外，拮抗菌還可通過改變傷口周圍的化學或滲透壓環(huán)境，使之適合拮抗生物生長而不利病原菌生長，從而提高寄主的抗病性。

5 與其他物質(zhì)的協(xié)同作用

拮抗微生物單獨作為果蔬產(chǎn)品采后生物保鮮劑使用時的控病能力相對于傳統(tǒng)的化學殺菌劑來講較低，誘導能力也比較有限，這也是限制商業(yè)生物保鮮劑開發(fā)與應(yīng)用的關(guān)鍵因素[23]。提高拮抗微生物誘導果蔬采后抗病性的能力主要可通過復(fù)合添加一些特定的抗病誘導因子來實現(xiàn)，這些物質(zhì)主要有：水楊酸(SA)、茉莉酸(JA)及其酯類、還有某些金屬鹽類以及一些生長調(diào)節(jié)劑如赤霉素等。Cao等[24]在研究拮抗酵母對枇杷炭疽病的防治效果時發(fā)現(xiàn)用茉莉酸甲酯(methyl jasmonate，MeJA)與膜醭畢赤酵母(Pichia membranefaciens)復(fù)合處理時，幾丁質(zhì)酶和β-1,3-葡聚糖酶的活性比單獨用拮抗酵母或茉莉酸甲酯處理要高，能夠更好地抑制炭疽病的發(fā)生。俞庭等[25]在研究羅倫隱球酵母(Cryptococcus laurentii)與水楊酸(salicylic acid，SA)復(fù)合對梨果實青霉及灰霉病的防治效果時發(fā)現(xiàn)復(fù)合處理也比單獨使用拮抗酵母或水楊酸效果好。另外的研究也表明將絲孢酵母菌(Trichosporon spp.)、黏紅酵母菌(Rhodotorula glutinis)、畢赤酵母菌(Pichia spp.)與Ca2+配合使用時對蘋果灰霉病、青霉病、柑橘綠霉病以及桃根霉腐爛病的抑制效果明顯增強，還可抑制Rhizopus stolonifer菌孢子的萌發(fā)和菌絲的生長[2,26]。羅倫隱球酵母(Cryptococcus laurentii)與赤霉素(gibberellic acid，GA3)復(fù)合處理梨果實在控制梨青霉病的效果上優(yōu)于單獨使用赤霉素[18]。除了通過在拮抗菌懸浮液中添加各種生物或化學抗病誘導物質(zhì)外，也可將拮抗菌與物理誘導方法相結(jié)合以提高拮抗菌制劑的誘導抗病性能力。如將經(jīng)過拮抗菌假單胞菌(Pseudomonas glathei)處理的柑橘果實在24h后以30℃進行熱處理能顯著增強果實對綠霉病的抗病能力[27]。

6 結(jié) 語

利用拮抗微生物誘導采后果蔬抗病性，達到抑制病害發(fā)生、減少病害危害的目的，滿足人們追求健康、保護環(huán)境的需求，適應(yīng)社會發(fā)展的方向。但目前國內(nèi)外只有Biosave拮抗菌株為洋蔥假單胞菌(Pseudomonas syringae Van Hall)和拮抗菌株美極美奇酵母(Metschnikowia fructicola)，這兩種拮抗菌商業(yè)生物保鮮劑真正應(yīng)用于實際生產(chǎn)，且市場占有率都極低[28]。而近年來應(yīng)用于美國和以色列的生物保鮮劑AspireTM(拮抗菌株為假絲酵母，Candida oleop hila)已經(jīng)由于其商業(yè)不適用性而退出市場。誘抗高效性和持久性方面的欠缺是拮抗菌生物保鮮制劑在商業(yè)應(yīng)用方面屢屢受阻的主要原因[29]。由于果蔬產(chǎn)品的逐漸衰老和采摘后的能量短缺會大大降低產(chǎn)品的抗性反應(yīng)，這使得果蔬產(chǎn)品的采后誘導抗性難以逾越采前的水平。此外，將拮抗菌保鮮制劑運用于生產(chǎn)實踐的困難還來源于實驗室研究與商業(yè)化應(yīng)用之間缺乏聯(lián)系，實驗室研究往往只考慮到拮抗菌對已知病害特別是外部侵染病害的控制能力，而忽略了果蔬內(nèi)部的潛在性感染，更加無法預(yù)測果蔬在貯藏、運輸、銷售過程中可能遭受的各種復(fù)雜的不穩(wěn)定環(huán)境因素，這也在一定程度上加劇了拮抗菌實際應(yīng)用的難度。要提高拮抗菌在采后貯藏環(huán)境中控制病害的效率應(yīng)該在繼續(xù)優(yōu)選性狀優(yōu)良的拮抗菌的基礎(chǔ)上，將采前與采后誘導防治工作結(jié)合起來，更多的考慮復(fù)合其他物理化學處理措施來提高拮抗微生物誘抗防病的能力，并且要從分子生物學的水平對誘導抗性及其他拮抗機制，尤其是植物誘導抗病的信號轉(zhuǎn)導和分子機制等問題進行深入研究。

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Disease-resistant Mechanism of Post-harvest Fruits and Vegetables Induced by Antagonists

LUO Yang1，MING Jian1,2，ZENG Kai-fang1,2,*
(1. College of Food Science, Southwest University, Chongqing 400715, China；2. Chongqing Special Food Programme and Technology Research Center, Chongqing 400715, China)

Disease-resistant mechanism of post-harvest fruits and vegetables induced by antagonists has been reviewed. The antagonists improved resistance to disease in fruits and vegetables by improving the content of phyto alexi and the activities of defense enzymes such as chintinase (CHI), β-1,3-glucanase, phenylalanine ammonia-lyase (PAL), peroxidase (POD) and polyphenol oxidase (PPO). The antagonists also regulated the active oxygen metabolism, and strengthened the resistance of organization structure in fruits and vegetables. These studies on disease-resistant mechanism induced by the antagonists will provide

for the application of biological technology for disease control in post-harvest fruits and vegetables.

biological control；antagonist；post-harvest disease；induced disease-resistant mechanism

S609.3；S667.7

A

1002-6630(2010)09-0297-04

2009-07-18

國家自然科學基金項目(30700556)；“十一五”國家科技支撐計劃項目(2006BAD22B03)；西南大學研究生科技創(chuàng)新基金項目(ky2009010)

羅楊(1986—)，女，碩士研究生，研究方向為食品貯藏工程。E-mail：594luoyang@163.com

*通信作者：曾凱芳(1972—)，女，副教授，博士，研究方向為食品貯藏工程。E-mail：zengkaifang@163.com