葡萄酒釀造及葡萄酒酵母菌種的改良

王曉飛，吳曉玉，孔令保

（江西農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院發(fā)酵應(yīng)用技術(shù)南昌市重點實驗室，江西南昌330045）

葡萄酒釀造及葡萄酒酵母菌種的改良

王曉飛，吳曉玉，孔令保*

（江西農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院發(fā)酵應(yīng)用技術(shù)南昌市重點實驗室，江西南昌330045）

釀酒酵母是一種重要的工業(yè)微生物，是葡萄酒品質(zhì)的靈魂。在無氧條件下，由葡萄轉(zhuǎn)化成葡萄酒的過程中，釀酒酵母起了至關(guān)重要的作用。敘述了葡萄酒酵母與葡萄酒釀造的關(guān)系，介紹了工業(yè)化葡萄酒發(fā)酵過程中的調(diào)控手段及當(dāng)前應(yīng)用現(xiàn)代科技手段選育優(yōu)良葡萄酒酵母菌種的方法，最后，對當(dāng)前釀酒行業(yè)的形勢和未來作出了預(yù)測和展望。

酵母，葡萄酒，DNA微陣列技術(shù)，LONWORKS技術(shù)，菌種選育

葡萄酒是一種營養(yǎng)豐富的低酒精度發(fā)酵飲料。葡萄酒釀造是在釀酒酵母的作用下，采用自然發(fā)酵或者純種發(fā)酵將葡萄原料中的各種潛在質(zhì)量在酒中充分發(fā)揮出來。釀酒酵母是一種應(yīng)用廣泛的工業(yè)微生物，長期以來它被用于發(fā)酵生產(chǎn)面包和酒精飲料，近來，酵母又被廣泛用于制藥行業(yè)和塑料工業(yè)，作為“細(xì)胞工廠”生產(chǎn)胰島素、聚酮和L-乳酸等。釀酒酵母也是進(jìn)行真核生物研究的一種很好的模式生物。自從1996年釀酒酵母全基因組測序工作的完成，人們對葡萄酒酵母的復(fù)雜代謝過程有了越來越多的認(rèn)識，研究人員深入開展了酵母的分子生物學(xué)研究［1］?；蚪M測序獲得的巨大生物學(xué)信息量呼喚新的后基因組學(xué)研究如酵母基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制的研究，高通量的組學(xué)研究如基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄物組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝物組學(xué)研究，以及應(yīng)用生物信息學(xué)對獲得的生物信息進(jìn)行分析整合的系統(tǒng)生物學(xué)研究。在現(xiàn)代葡萄酒發(fā)酵過程中應(yīng)用LONWORKS系統(tǒng)，通過計算機(jī)遠(yuǎn)程通訊將所有酒罐的信息儲存在網(wǎng)絡(luò)服務(wù)器上，工作人員隨時可以查閱酒罐溫度、儲量、密度等信息，實現(xiàn)對發(fā)酵過程的現(xiàn)代化、網(wǎng)絡(luò)化、自動化的監(jiān)控與調(diào)控。為了滿足不同地區(qū)、不同人群、不同風(fēng)格的葡萄酒消費需求，優(yōu)良葡萄酒酵母的選育工作尤其重要。傳統(tǒng)的自然篩選、采用理化因素的誘變等經(jīng)典的育種手段仍是目前實用的常規(guī)技術(shù)，隨著現(xiàn)代科技的發(fā)展，出現(xiàn)了很多選育酵母的新技術(shù)如基因重組、基因工程育種等手段。

1 葡萄酒釀造的關(guān)鍵因子——葡萄酒酵母

葡萄酒是以葡萄汁為原料，在一定條件下經(jīng)酵母部分或完全發(fā)酵所得的低度飲料酒。從物理化學(xué)角度，葡萄酒可以定義為一種非理性的、多組成分的透明溶液，包含主要成分水、酒精、甘油和有機(jī)酸，次要成分如芳香氣味和石碳酸復(fù)合物等［2］。其風(fēng)味物質(zhì)主要來源于葡萄本身和由酵母發(fā)酵代謝產(chǎn)生的物質(zhì)，其含量和組成比例決定著葡萄酒的特性。

酵母是葡萄酒釀造的靈魂。在無氧條件下，由葡萄轉(zhuǎn)化成葡萄酒的過程中，釀酒酵母的作用至關(guān)重要。在自然或自發(fā)發(fā)酵情況下，微生物的群體消長現(xiàn)象是自發(fā)進(jìn)行的，其必要條件也隨時間的變化而改變，包括真菌、酵母、細(xì)菌（醋酸菌、乳酸菌）和病毒（真菌病毒和抗菌素）的相互作用。微生物群體間的相互作用引發(fā)協(xié)同效應(yīng)，促使芳香類化合物的生成，這類化合物不是簡單的通過混合各純培養(yǎng)發(fā)酵的成分就能實現(xiàn)的。這點已由近期的代謝足跡技術(shù)，通過單純培養(yǎng)、混合發(fā)酵和將幾種酒混雜的方法，利用氣相色譜分析發(fā)酵產(chǎn)物中揮發(fā)性物質(zhì)的組分，予以證實［3］。在實際應(yīng)用中，葡萄酒活性干酵母為葡萄酒品質(zhì)控制提供了非常有效的手段和保證。在發(fā)酵中，活性干酵母在數(shù)量上占相對優(yōu)勢，能形成同質(zhì)性及穩(wěn)定性的群體，使葡萄酒釀造者更易于測試其純度、活性及酵母菌種特征。從生物技術(shù)角度，活性干酵母的應(yīng)用對微生物學(xué)發(fā)酵過程具有深遠(yuǎn)的影響。

另外，葡萄酒發(fā)酵過程中，必須防止一些有害微生物的侵染，如灰葡萄孢菌會影響風(fēng)味獨特、高檔的貴腐葡萄酒的釀造，啤酒、葡萄酒、清酒釀造中出現(xiàn)過嗜殺酵母現(xiàn)象［4］，造成酵母污染，并影響酒的風(fēng)味，甚至引起酒變質(zhì)，阻礙釀酒的正常進(jìn)行。近期，功能基因組技術(shù)的應(yīng)用，在相應(yīng)的工業(yè)環(huán)境條件下，對識別被協(xié)迫控制的基因、控制代謝的轉(zhuǎn)錄因子及相關(guān)的工藝性能具有重要的作用［5］。酵母作為一個體系明確的生物體，在可以操控的前提下，以其獨特的優(yōu)良特性，成為研究“系統(tǒng)生物學(xué)”、洞悉特定環(huán)境條件下某一具體表型調(diào)節(jié)機(jī)制的“模式生物”［6］。

2 葡萄酒發(fā)酵操控

酒精發(fā)酵是一個動力學(xué)的、復(fù)雜的過程，在此過程中，由于環(huán)境培養(yǎng)條件發(fā)生巨大變化以及發(fā)酵酵母的生理活性，葡萄要經(jīng)歷持續(xù)的轉(zhuǎn)變。釀酒工業(yè)化生產(chǎn)遠(yuǎn)比實驗室條件下小量的葡萄酒制作艱難復(fù)雜。工業(yè)生產(chǎn)用釀酒酵母菌株與實驗室品系差異顯著，實驗室用的品種多為單倍體或雙倍體。工業(yè)用葡萄酒酵母菌株主要是雙倍體或非整倍體，個別多倍體表現(xiàn)出染色體長度的高度多態(tài)性［7］。實驗室培養(yǎng)用葡萄酒酵母菌株與工業(yè)生產(chǎn)用葡萄酒酵母菌株在對環(huán)境變化所作出的反應(yīng)上也存在著明顯差異［8］。因此，為了保持細(xì)胞的完整性以及整個釀酒過程的代謝活性，釀酒酵母形成了一整套機(jī)制以靈活適應(yīng)不斷變化的環(huán)境條件。下面簡要介紹葡萄酒發(fā)酵的操控手段：

在葡萄酒發(fā)酵操控系統(tǒng)中，要求精確地控制葡萄汁發(fā)酵溫度和密度，使發(fā)酵按照既定的質(zhì)量要求發(fā)展。然而，發(fā)酵的動態(tài)復(fù)雜性使溫度很難人為控制，造成香味揮發(fā)、口感粗糙，甚至蠅蟲滋生、發(fā)酵驟停等惡性事件，因此需要一套完備的控制系統(tǒng)操控發(fā)酵過程?，F(xiàn)代釀酒車間利用LONWORKS系統(tǒng)實現(xiàn)對發(fā)酵的操控目的。系統(tǒng)是由一個主機(jī)節(jié)點和若干個LON節(jié)點構(gòu)成的集散系統(tǒng)。通過計算機(jī)遠(yuǎn)程通訊將所有酒罐的信息儲存在網(wǎng)絡(luò)服務(wù)器上，在有關(guān)人員的聯(lián)網(wǎng)計算機(jī)上，可以隨時查閱所有酒罐的儲量、密度、液位、酒種、發(fā)酵過程的密度曲線、溫度曲線等實時數(shù)據(jù)和歷史數(shù)據(jù)。決策者及管理人員能夠及時掌握生產(chǎn)情況，進(jìn)而進(jìn)行生產(chǎn)調(diào)度和指揮，對釀造過程的生產(chǎn)管理和質(zhì)量管理具有極高的使用價值。LONWORKS這一高新技術(shù)的引用顯示了釀酒行業(yè)正朝著網(wǎng)絡(luò)化和工業(yè)化的方向邁進(jìn)［9］。

網(wǎng)絡(luò)組成分析（NCA）是一種由轉(zhuǎn)錄分析如DNA微陣列或SAGE重建調(diào)節(jié)信號的方法，用于確定發(fā)酵過程中位于某一特定的點的轉(zhuǎn)錄因子是否具有活性［10］。DNA微陣列技術(shù)是鑒別混合在一起的各種細(xì)菌的理想工具，可以得到細(xì)菌豐度和細(xì)菌種類的信息。利用該技術(shù)比對標(biāo)準(zhǔn)實驗室菌種、突變異種和工業(yè)酵母菌基因型，進(jìn)而得到適合消費者和商家需要的理想酵母。微陣列技術(shù)也是評價基因表達(dá)的主要工具，這項技術(shù)可以用于發(fā)酵過程中陽性性狀的基因表達(dá)分析。尤其對獲得那些調(diào)控序列，即用于操控只能在上述條件下才能進(jìn)行轉(zhuǎn)錄的自然的或被導(dǎo)入基因產(chǎn)物的表達(dá)是非常有幫助的。用SAGE和微陣列技術(shù)所獲得的結(jié)果相類似，但因為SAGE不需要精確了解酵母基因序列，因此SAGE對于新基因的發(fā)現(xiàn)是非常有意義的。

3 葡萄酒酵母菌種的改良

為了滿足不同地區(qū)、不同人群、不同風(fēng)格的葡萄酒消費需求，優(yōu)良葡萄酒酵母的選育工作尤其重要。真正優(yōu)良的葡萄酒酵母應(yīng)該具備起酵快，擁有連續(xù)發(fā)酵能力和可描述性，能耐酒精、高壓、高SO2、高溫，能產(chǎn)生甘油和糖苷酶，但不失芳香和口感，并且能使發(fā)酵過程進(jìn)行地完全，殘?zhí)巧?，酒體協(xié)調(diào)，易于長期儲存等優(yōu)點［11］。葡萄酒生產(chǎn)商為了使其產(chǎn)品在市場上有競爭力，希望得到發(fā)酵性能更優(yōu)異的葡萄酒酵母菌株。例如：增加活性干酵母的抗脅迫能力和恢復(fù)能力，改善酵母對葡萄汁中糖分和氮素的吸收與同化，提高酵母對乙醇、其它微生物的代謝產(chǎn)物及毒素的耐受力，提高它們對亞硫酸鹽、重金屬和農(nóng)業(yè)化學(xué)殘留物的耐受力，減少發(fā)酵過程中泡沫的形成，借助抗菌酶和多肽的表達(dá)或二氧化硫的代謝生產(chǎn)以實現(xiàn)對有害微生物的控制等。消費者對葡萄酒品質(zhì)要求也在不斷提高，口味日趨多樣化，傾向于新型、健康的葡萄酒。例如：要求增加葡萄酒中有益于健康的物質(zhì)如白藜蘆醇和水楊酸等，以及涉及葡萄酒風(fēng)味的物質(zhì)如酯類和醇類等的含量；減少葡萄酒中的酒精含量以及可能存在的微量有害物質(zhì)如被懷疑有致癌可能的氨基甲酸乙酯和神經(jīng)毒素生物胺等［12-13］。葡萄酒廠和消費者的這些需求直接推動了葡萄酒酵母的篩選和改良。

傳統(tǒng)的自然篩選、采用理化因素的誘變等經(jīng)典的育種手段仍是目前最實用的常規(guī)技術(shù)，隨著現(xiàn)代科技的發(fā)展，出現(xiàn)了很多選育酵母的新技術(shù)如基因重組、基因工程育種等手段。

3.1 酵母的基因重組

采用雜交、接合、轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)導(dǎo)等遺傳學(xué)方法，把兩個不同形狀個體內(nèi)的基因放在一起，經(jīng)遺傳交換（crossing over），重新組合后，使外源目的基因進(jìn)入酵母細(xì)胞，并得以表達(dá)，以期使得酵母細(xì)胞在原有性狀的基礎(chǔ)上，獲得人們所需要的特殊性狀?；蛑亟M技術(shù)是菌種改良的重要手段。

3.1.1 雜交育種 雜交育種利用了酵母的生活史、不同遺傳特性和相反交配型的細(xì)胞產(chǎn)生的雙倍體等特點。這種育種方式可以消除菌株在經(jīng)歷長期誘變后所出現(xiàn)的產(chǎn)量性狀難以繼續(xù)提高的障礙。如利用選自乳清的釀酒酵母與葡萄汁酵母為親本進(jìn)行雜交，可以在獲得雜合子的同時又具有兩個親本的優(yōu)良性狀（分解蘋果酸能力強(qiáng)和生成乙酸能力弱）［14］。

3.1.2 細(xì)胞融合育種 細(xì)胞融合育種是將兩種不同的菌株經(jīng)酶法去壁后，得到的原生質(zhì)體，置于高滲溶液中，在融合劑的作用下產(chǎn)生細(xì)胞之間的融合，進(jìn)而導(dǎo)致基因重組，獲得融合了親本優(yōu)良性能的新菌株的育種方法［15］。陳海昌等［16］用啤酒酵母和糖化酵母進(jìn)行原生質(zhì)體融合，篩選出融株，既有較高的發(fā)酵度和絮凝性，又能水解淀粉和糊精，適宜生產(chǎn)低糖啤酒。微生物細(xì)胞融合技術(shù)是通過改變微生物細(xì)胞的遺傳性進(jìn)行育種。高年發(fā)等［17］采用賴氨酸缺陷型釀酒酵母原生質(zhì)與肌醇缺陷型粟酒裂殖酵母原生質(zhì)體融合選育了葡萄酒發(fā)酵性能良好且具有降解蘋果酸能力的酵母菌株。它不受親緣關(guān)系影響，可克服細(xì)胞壁的天然屏障，遺傳信息傳遞量大，不需了解雙親詳細(xì)的遺傳背景，便于操作，而且原生質(zhì)體的再生過程本身也可以認(rèn)為是篩選的過程。所以可以在種內(nèi)、屬內(nèi)、屬間甚至跨界進(jìn)行，并且在各個領(lǐng)域中都取得了一定的效果。

值得一提的是跨界融合技術(shù)，其作為細(xì)胞融合技術(shù)的一個擴(kuò)展領(lǐng)域，具有很大的前景和挑戰(zhàn)性。然而由于跨界融合的親緣關(guān)系甚遠(yuǎn)，融合難度大，篩選困難，且融合后代遺傳穩(wěn)定性差等原因［18］，因此跨界融合成功的事例并不多見。期待將來利用酵母的天然優(yōu)良品質(zhì)，打破種屬間界線，應(yīng)用跨界融合技術(shù)，為葡萄酒釀造研發(fā)出更佳的酵母菌株。

3.1.3 Genome shuffling技術(shù) Genome shuffling技術(shù)是在傳統(tǒng)誘變基礎(chǔ)上，通過多輪遞推細(xì)胞融合技術(shù)的方式，使誘變后的酵母細(xì)胞進(jìn)行基因組重組，進(jìn)而提高酵母細(xì)胞的正向突變頻率及正向突變速度，最終從獲得的突變體庫中篩選出所需要的酵母菌株。Genome shuffling技術(shù)在只了解微生物遺傳性狀的基礎(chǔ)上實現(xiàn)了微生物的定向育種，獲得了大幅度正突變的菌株，也成為微生物發(fā)酵工程中的一種有效的工具。陸筑鳳等［19］采用了紫外誘變和 Genome shuffling技術(shù)相結(jié)合的方法篩選得到既耐高溫又耐乙醇的酵母菌，選育出高溫下能高產(chǎn)乙醇和香味物質(zhì)的釀酒酵母。

3.2 基因工程育種

基因工程育種是從生物體內(nèi)提取出所要表達(dá)的基因或人工合成的DNA片段，導(dǎo)入適當(dāng)?shù)妮d體，再轉(zhuǎn)人釀酒酵母細(xì)胞中，使遺傳物質(zhì)重新組合，從而實現(xiàn)對釀酒酵母的改良。自從1996年釀酒酵母全基因組測序工作的完成，人們對葡萄酒酵母的復(fù)雜代謝過程有了越來越多的認(rèn)識。迄今為止，科學(xué)家們已為葡萄酒酵母發(fā)展了多種有效的質(zhì)粒載體和基因轉(zhuǎn)移方法，以及用于外源基因在酵母體內(nèi)表達(dá)和產(chǎn)物分泌的表達(dá)和分泌盒。上述葡萄酒酵母基因組學(xué)和分子生物學(xué)的研究成果，以及近些年生物信息學(xué)的迅速發(fā)展為新型酵母菌株的基因設(shè)計和選擇提供了更廣的適用性和更強(qiáng)的專一性手段，使葡萄酒酵母的分子改良取得了許多進(jìn)展，例如：過量生產(chǎn)甘油［20］、降低酒精的含量、增加酚類化合物的釋放、減少乙烷基氨基甲酸鹽的生成［21］、增加葡萄抗氧化劑白藜蘆醇的生成［22］和酯類物質(zhì)的生成等。

根據(jù)目的基因的來源和所構(gòu)建的酵母基因工程菌是否含有外源DNA片段，可以將酵母菌的遺傳修飾分為非自身克隆和自身克隆兩種技術(shù)。通過自身克隆技術(shù)構(gòu)建的酵母基因工程菌中，不但目的基因來源于酵母菌本身，而且不引入任何其他的外源DNA片段，所以這種酵母基因工程菌更容易被企業(yè)和消費者接受和應(yīng)用到生產(chǎn)實踐中。近來，這項技術(shù)已被應(yīng)用于葡萄酒酵母菌株的改良。Coulon J等通過把DUR1，2基因置于PGK1啟動子的控制之下，獲得了減少產(chǎn)生致癌物氨基甲酸乙酯的菌株［21］。隨著分子生物學(xué)和分子遺傳學(xué)的發(fā)展，利用基因工程技術(shù)將會定向地對釀酒酵母進(jìn)行改造與構(gòu)建，從而獲得具有更加優(yōu)良釀造特性的葡萄酒酵母。

此外，關(guān)于菌種選育的其它方法如離子束注入、激光誘變、高壓靜電等方法的應(yīng)用，也展現(xiàn)了新的前景。

4 結(jié)語

葡萄酒因具有很高的營養(yǎng)和保健作用而越來越受到人們的青睞，人們對葡萄酒的消費越來越注重品質(zhì)。生產(chǎn)廠家為了在競爭日趨激烈的葡萄酒市場中立于不敗之地，也需要想盡一切辦法來降低生產(chǎn)成本和提高葡萄酒的品質(zhì)。生物技術(shù)在二十一世紀(jì)為提高葡萄酒的品質(zhì)，降低優(yōu)質(zhì)葡萄酒的生產(chǎn)成本，滿足不同消費者多元化的個性需求，提供了更為廣闊的可能和選擇空間。葡萄酒酵母是葡萄酒品質(zhì)的靈魂，對葡萄酒產(chǎn)量、色澤、香氣、感官質(zhì)量和風(fēng)格的影響非常重要，用不同菌種發(fā)酵生產(chǎn)的葡萄酒，其產(chǎn)量、酒質(zhì)和風(fēng)味大不相同。因此應(yīng)用現(xiàn)代科技手段調(diào)控葡萄酒發(fā)酵工藝和選育優(yōu)良酵母菌種是目前葡萄酒研究領(lǐng)域的熱點之一。在基因技術(shù)應(yīng)用方面，對消費者和生產(chǎn)者同樣都有著巨大的潛在效益。葡萄酒行業(yè)的趨勢可能會根據(jù)消費者的喜好訂制菌株，這樣大量的葡萄酒必將開辟適合特殊消費者群體的特殊市場。盡管很多經(jīng)基因改良的酵母由于生物安全性不能保證而無法應(yīng)用到工業(yè)生產(chǎn)上，但隨著具備較高生物安全性的自克隆技術(shù)的發(fā)展，相信在不遠(yuǎn)的將來會有越來越多的基因改良的葡萄酒酵母菌株應(yīng)用到葡萄酒釀造過程之中。

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Wine brewing and the improvement of wine yeast species

WANG Xiao-fei，WU Xiao-yu，KONG Ling-bao*
（Key Laboratory of Fermentation Applied Technology，College of Biological Science and Engineering，Jiangxi Agricultural University，Nanchang 330045，China）

Saccharomyces cerevisiae is an important industrial micro-organism，which is the soul of the wine quality.ln anaerobic conditions，Saccharomyces cerevisiae has played a crucial role in the process from grape to wine.The relationship of wine yeast and wine brewing was described.And the manipulation methods occurred in wine industrialization fermentation process，the current application of modern scientific and technological means to breed wine yeast species were also introduced.Finally，the current situation and future prospects for the wine brewing industry was discussed and viewed.

yeast；wine；DNA microarray technology；LONWORKS technology；strain breeding

TS262.6

A

1002-0306（2010）11-0420-04

2009-09-07 *通訊聯(lián)系人

王曉飛（1983-），女，碩士研究生，主要從事微生物次級代謝產(chǎn)物方向的研究。