雙向凝膠電泳技術在中醫(yī)證候研究中的應用

陳 冰

(中國中醫(yī)科學院中醫(yī)基礎理論研究所，北京市東直門內(nèi)南小街 16號，100700)

雙向凝膠電泳技術自從問世以來便廣泛應用于各種領域，現(xiàn)已成為蛋白質(zhì)組學的核心技術，由于其整體性、實時性等特點，近年來大量應用于中醫(yī)證候研究方面。本文擬對雙向電泳技術在證候研究中的應用做一綜述。

1 雙向電泳技術原理及應用

雙向電泳(two-dimensional gel electrophoresis，2-DE)是根據(jù)蛋白質(zhì)等電點和分子量的不同，通過兩次方向互相垂直的高分辨率等電聚焦電泳和十二烷基磺酸鈉一聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulphate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)，將帶不同凈電荷和不同分子量的蛋白質(zhì)二維平面上呈點狀分開的技術。雙向電泳技術 1975年由意大利生化學家O'Farrell發(fā)明[1]，可以在一個平面上分離出數(shù)以千計的蛋白質(zhì)，適用于整體水平生命活動規(guī)律的研究[2]。它以高分辨率、簡單、快速等優(yōu)點被廣泛應用于蛋白質(zhì)組學研究，是目前分離復雜蛋白質(zhì)組分最常用的工具。通過雙向電泳得到差異蛋白后，可結(jié)合其他蛋白質(zhì)組學研究方法進一步分析，如結(jié)合質(zhì)譜技術進行差異蛋白質(zhì)的鑒定、相關數(shù)據(jù)庫檢索，將所獲結(jié)果進行生物信息學分析等。因此說，雙向電泳是蛋白質(zhì)組學的核心技術。

雙向電泳技術包括蛋白樣品制備、等電聚焦、SDSPAGE、染色等步驟。樣品制備非常關鍵，合理的樣品制備可保證 2-DE的重復性。盡量減少蛋白提取過程中的降解和丟失，以提高分辨率。等點聚焦是在存在 p H梯度和電場的條件下，蛋白質(zhì)分子向其凈電荷為零的 p H處移動，當樣本中的每一個蛋白質(zhì)均達到其電荷為零的 pH位置時，樣品蛋白質(zhì)就根據(jù)其等電點得到分離。SDS-PAGE有垂直和水平 2種方式。垂直方式是目前常用的電泳方式，陰離子去垢劑十二烷基磺酸鈉同蛋白質(zhì)合后形成項鏈樣結(jié)構(gòu)，并以 114∶1的比例結(jié)合，從而使蛋白質(zhì)帶有凈負電荷，使蛋白電泳時移動距離與其分子量呈正比。

雙向電泳常用的染色方法有考染色、銀染、熒光染色等方法。熒光差異雙向凝膠電泳(DIGE)是目前蛋白質(zhì)組學研究的熱門技術[3-4]。它是通過熒光染料與蛋白質(zhì)中的賴氨酸殘基進行結(jié)合，把不同熒光素標記的樣品在同一塊凝膠上進行分離，用不同波長的激光激發(fā)后可以顯示不同的顏色。DIGE技術的優(yōu)點是采用幾種不同的熒光染料(Cy3、Cy5、Cy2)分別標記不同的蛋白質(zhì)樣品，并設立內(nèi)標，可以在同一塊膠上同時分離 2種以上蛋白質(zhì)樣品，比較同一蛋白在不同樣品中的豐度[5-6]。由于每塊凝膠中加入了內(nèi)標，降低了普通雙向凝膠電泳中不同凝膠間的誤差，減少了實驗重復次數(shù);且靈敏度高，可以對相對微量的蛋白質(zhì)進行定量研究。DIGE實驗中一般用 Cy2標記內(nèi)標，用 Cy3、Cy5分別交叉標記不同膠間的樣品，這就避免了不同染料對實驗結(jié)果的影響。其分析軟件能自動進行蛋白質(zhì)點的識別和匹配，可消除人為因素，增加實驗的準確性和重復性[7-8]。因此，DIGE技術具有較高的敏感性、特異性及較寬的動態(tài)范圍等優(yōu)點，非常適用于樣本數(shù)較少，蛋白豐度范圍大的實驗研究。目前已有學者將該項技術應用于證候特征的研究方面，唐利華等發(fā)現(xiàn)了 17個差異蛋白質(zhì)可能與腎陽虛疾病有關[9]。雙向電泳技術還可以根據(jù)研究者的需要結(jié)合其他蛋白質(zhì)組學相關技術，如蛋白質(zhì)芯片、S質(zhì)譜等，目前雙向電泳加質(zhì)譜已經(jīng)成為蛋白質(zhì)組學研究的基本方法。

2 雙向電泳技術是研究中醫(yī)證候的重要方法

中醫(yī)證候是指在致病因素作用下，機體內(nèi)外環(huán)境各系統(tǒng)之間相互關系發(fā)生紊亂所產(chǎn)生的綜合反應，是反映疾病處于某一階段病因、病性、病位、病勢等病理因素的綜合性診斷概念，是致病因素與機體反應兩方面情況的綜合。證，是指對疾病所處的一定階段的病機概括，或非疾病機體的一定階段的機體狀態(tài)的概括;候，是指這種病機或狀態(tài)的可被觀察到的外在表現(xiàn)[10]。

蛋白質(zhì)組的概念最早由澳大利亞學者 Wilkins和Williams提出[11]，指由一個基因組、細胞、組織或生物所表達的全部蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)組學是以細胞或組織不同時間、環(huán)境的所有蛋白質(zhì)為研究對象，從整體上研究蛋白質(zhì)的種類、相互作用以及功能結(jié)構(gòu)的一門科學。而證候的整體性、時相性等特點與蛋白質(zhì)組學時空性與整體性的特點十分貼近。因此，應用蛋白質(zhì)組學方法對證候本質(zhì)進行研究已經(jīng)成為一種公認的方法，而作為蛋白質(zhì)組學中最重要的技術——雙向電泳，更是被廣泛使用。將蛋白組學引入證實質(zhì)研究，更有利于動態(tài)地揭示同一個研究對象不同時期的變動性，更符合證研究自身的特點。對不同中醫(yī)證候產(chǎn)生前后蛋白質(zhì)組學研究，探究中醫(yī)證候產(chǎn)生的物質(zhì)基礎支配機制，可以揭示中醫(yī)證候的科學內(nèi)涵，能夠為中醫(yī)診斷的客觀化提供依據(jù)和方法。尋找與證候相關的差異標志蛋白群，制定標準參照物，使得疾病的辨證分型及用藥具有客觀性、準確性及重復性[12]。

3 雙向電泳技術在中醫(yī)證候研究中的應用

以雙向電泳技術為代表的蛋白質(zhì)組學方法近些年來已經(jīng)大量應用于中醫(yī)證候的研究中。劉萍[13]等通過雙向電泳技術，成功建立了脾腎虛型重癥肌無力患者血清 2-DE圖譜。其中在正常對照組雙向電泳圖譜上觀察到了 1463±179個蛋白點，而重癥肌無力組共觀察到 1508±89個蛋白點。選取具有明顯差異的21個蛋白點進行質(zhì)譜鑒定，共鑒定出 8種差異蛋白。趙慧輝[14]等采用雙向凝膠電泳結(jié)合基質(zhì)輔助激光解析/電離 -飛行時間質(zhì)譜對 8例心絞痛血瘀證患者血瘀證程度變化前后的血漿進行比較蛋白質(zhì)組學研究，尋找心絞痛血瘀證相關蛋白。結(jié)果初步發(fā)現(xiàn)了 Clusterin、ApoA-I在血瘀證程度變輕后表達增加，而 Fibrinogenβchain、Vitamin D-Binding Protein、Haptoglobin βchain、Albumin isoform在血瘀證程度變輕后表達降低。譚秦湘等[15]以不同疾病組肝郁證患者和正常人的血清為樣本，采用雙向凝膠電泳分離蛋白質(zhì)組分，通過分析比較正常組與肝郁證組血清蛋白質(zhì)圖譜，探詢其物質(zhì)基礎，經(jīng)分析后發(fā)現(xiàn)肝郁證差異蛋白質(zhì)群。張嫻[16]等在對自發(fā)性高血壓大鼠組和高血壓肝陽上亢模型組大鼠肝臟蛋白質(zhì)組的雙向電泳分析中發(fā)現(xiàn)，大部分蛋白集中分布在 PI 5～8的區(qū)域。研究人員認為應用蛋白質(zhì)組分析技術能較全面地了解模型的蛋白表達情況，有利于篩選證候相關蛋白，是研究中醫(yī)證候的可行途徑之一。戰(zhàn)麗彬[17]等應用雙向電泳技術，通過2-DE圖像分析軟件 ImageMaster 5.0對大鼠脾陰虛組和空白對照組海馬蛋白質(zhì)組進行分析，可分辨 2組蛋白斑點數(shù)目分別為(2027±61)個和(1917±207)個。將圖譜部分區(qū)域放大后顯示出明顯差異，初步篩選出脾陰虛大鼠海馬蛋白質(zhì)組的差異表達，研究人員推測與學習記憶相關。劉希成[18]利用雙向電泳優(yōu)化分離了除去高豐度蛋白(白蛋白和 IgG)的老年體虛腎陽虛患者(以健康組為參照)的血清樣本，對比分析pH4～7范圍的 2-DE圖譜，發(fā)現(xiàn)腎陽虛患者和參照組的平均蛋白點分別為(393±32)和(455±19)個。其中腎陽虛證候表達量上調(diào) 2倍(P＜0.05)以上的蛋白點有 26個，下調(diào) 2倍以上的有 33個。結(jié)合質(zhì)譜獲得上述差異蛋白的肽質(zhì)量指紋圖譜，并經(jīng)數(shù)據(jù)庫檢索共鑒定出了 49種差異蛋白質(zhì)，其中有 10種在腎陽虛血清中特異表達，有 6種在健康組血清中特異表達。蛋白功能分析發(fā)現(xiàn)，其中 33種蛋白質(zhì)的差異表達與腎陽虛證密切相關。蛋白質(zhì) TCRβ及 transthyretin的蛋白印跡實驗驗證了 2-DE的結(jié)果。研究人員認為該研究結(jié)果為闡明中醫(yī)腎陽虛證的機理提供了一條新途徑。除此之外，還有學者利用雙向電泳技術對血虛證[19]、慢性胃炎濕證[20]等證候類型進行了研究。

4 存在問題與展望

雙向電泳的分辨率較高，近年來被廣泛應用于農(nóng)業(yè)、醫(yī)學等研究領域。但仍存在諸多問題:1)重復性差，自動化程度低;2)低豐度蛋白質(zhì)、極酸及極堿性蛋白質(zhì)、分子量過大或過小的蛋白質(zhì)及膜蛋白等分離困難。針對上述問題，可采用如二維色譜、二維毛細管電泳、液相色譜 -毛細管電泳等新型分離技術作為雙向電泳的補充。而且隨著高通量和高精度蛋白質(zhì)新型檢測技術的出現(xiàn)，雙向電泳技術可以得到進一步完善。雙向電泳技術結(jié)合蛋白質(zhì)的生物質(zhì)譜鑒定及其與生物信息學的結(jié)合一系列方法的建立，必將為中醫(yī)證候的研究提供更完備的支持。

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