表觀遺傳學(xué)與結(jié)直腸癌的關(guān)系研究進(jìn)展

李 臣綜述 陳明清 董 堅(jiān)審校

表觀遺傳學(xué)(Epigenetics)與遺傳學(xué)(Genetics)是相對(duì)應(yīng)的概念。遺傳學(xué)改變是指基于基因序列改變所致基因表達(dá)水平變化,如基因突變、基因雜合丟失和微衛(wèi)星不穩(wěn)定等;而表觀遺傳學(xué)改變則是指基于非基因序列改變所致基因表達(dá)水平變化,如DNA甲基化、組蛋白修飾和基因組印跡等。研究表明遺傳和表觀遺傳異常都參與腫瘤的發(fā)生。

結(jié)直腸癌是常見的惡性腫瘤之一,全世界每年大約有 120萬新發(fā)病例,同時(shí)至少60萬患者死亡[1]。結(jié)直腸癌有著極為復(fù)雜的發(fā)生發(fā)展機(jī)制,傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為腫瘤的主要機(jī)制是由于致癌因素造成 DNA序列變異而導(dǎo)致細(xì)胞生長、分化失控。近年來,隨著研究的深入,發(fā)現(xiàn)DNA序列以外的調(diào)控機(jī)制異常在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中更為普遍[2],這種不依賴于DNA序列變化的可遺傳的調(diào)控機(jī)制即為表觀遺傳學(xué)機(jī)制,這也為結(jié)直腸癌的診斷和治療開辟了新的途徑。

1 表觀遺傳學(xué)分子機(jī)制與結(jié)直腸癌

1.1 DNA甲基化與結(jié)直腸癌

DNA甲基化是指由 DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DN-MT)催化,把 S-腺苷甲硫氨酸(SAM)的甲基轉(zhuǎn)移到胞嘧啶 5位碳原子上,生成5-甲基胞嘧啶(5-mC)引起基因表達(dá)異常的過程。DNA甲基化包括整體基因組的低甲基化和啟動(dòng)子特殊區(qū)域 CpG島的高甲基化。在散發(fā)性直結(jié)腸癌中,這兩種表觀遺傳學(xué)變化在基因不穩(wěn)定性產(chǎn)生過程中起著重要作用。

1.1.1 整體基因組低甲基化與結(jié)直腸癌 研究表明:腫瘤細(xì)胞中 DNA甲基化水平只為相應(yīng)正常細(xì)胞的 1/3～1/4,從而導(dǎo)致重復(fù)序列的轉(zhuǎn)錄/轉(zhuǎn)座活化和基因組的高度不穩(wěn)定性。結(jié)直腸癌組織中 5-mC含量與正常組織相比亦有明顯的下降。低甲基化可引起癌基因如 MDR 1、Ras、c-myc、NT活化,參與腫瘤的發(fā)生。在散發(fā)性結(jié)直腸癌中,這種低甲基化還與染色體不穩(wěn)定性(chromosomal instability,CIN)和微衛(wèi)星不穩(wěn)定性(microsatellite instability,MSI)有關(guān)。Matsuzaki等[3]的研究顯示整體基因組低甲基化可引起 CIN,該研究還發(fā)現(xiàn)微衛(wèi)星穩(wěn)定性(MSS)結(jié)腸癌中雜合性丟失(loss of heterozygosity,LOH)出現(xiàn)頻率較 MSI結(jié)腸癌高,且LOH陽性結(jié)腸癌甲基化程度明顯低于 LOH陰性結(jié)腸癌,同時(shí)低甲基化程度高的組織有更多的位點(diǎn)出現(xiàn) LOH。

1.1.2 區(qū)域性高甲基化與結(jié)直腸癌 除整體基因組低甲基化外,基因 CpG島區(qū)域的異常高甲基化同樣在腫瘤發(fā)展過程中起重要作用,這也是目前研究的熱點(diǎn),尤其是抑癌基因啟動(dòng)子區(qū)域CpG島高甲基化導(dǎo)致的轉(zhuǎn)錄沉默更是倍受關(guān)注,這也很可能是癌性增生的最初表現(xiàn)。

p16基因是重要的細(xì)胞周期調(diào)控基因,能夠使細(xì)胞周期穩(wěn)定在G1期,在多數(shù)胃癌和結(jié)直腸癌患者中表達(dá)下降。多數(shù)研究表明,除了少數(shù)為等位基因的純合性缺失外,啟動(dòng)子的過度甲基化是p16失活的主要原因。大約 30%的結(jié)腸癌患者有p16基因啟動(dòng)子的甲基化,而且p 16基因啟動(dòng)子過度甲基化的大腸癌具有一些特殊的臨床病理特征,如多為右半結(jié)腸、女性和低分化癌。

hMLH 1是DNA錯(cuò)配修復(fù)基因,大多數(shù)的遺傳性非息肉病性結(jié)直腸癌(hereditary nonpolyposis colorectal cancer,HNPCC)和部分散發(fā)性大腸癌(sporadic colorectal cancer,SCRC)(10% ～15%)表現(xiàn)為 MSI,但兩者發(fā)生 MSI的原因卻不相同,前者是由于錯(cuò)配修復(fù)基因的突變,而后者則主要是由于hMLH 1基因啟動(dòng)子的異常高甲基化導(dǎo)致hMLH 1基因的沉默表達(dá)引起。研究顯示MSI(+)的SCRC中 hMLH 1基因啟動(dòng)子過度甲基化的檢出率可高達(dá) 70%～90%[4],提示 hMLH 1啟動(dòng)子的過度甲基化與hMLH 1蛋白的失表達(dá)關(guān)系密切。

p14也是細(xì)胞周期調(diào)控基因,其作用機(jī)制是與癌蛋白MDM 2結(jié)合,加速 MDM 2降解并促進(jìn) MDM 2與 p53分離,促其誘導(dǎo)p53基因下調(diào)功能減弱,恢復(fù)和穩(wěn)定細(xì)胞 p53水平,增強(qiáng)p53在 G1S/和 G2/M的限制點(diǎn)效應(yīng),最終使細(xì)胞阻滯于 G1和(或)G2期。此為 p14-MDM2-p53通路學(xué)說,即 p14和 p53之間為負(fù)相關(guān),p 14的降低可導(dǎo)致p53的異常升高,從而在結(jié)直腸癌中發(fā)揮作用。p14可以通過等位基因的純合性缺失或基因啟動(dòng)子的過度甲基化而失活,研究顯示近 1/4的大腸癌發(fā)生p 14基因啟動(dòng)子的過度甲基化,且 p14啟動(dòng)子甲基化可能為潰瘍性結(jié)腸炎相關(guān)的大腸癌發(fā)生過程中的常見的早期分子事件。Kom inami等[5]的研究表明在大腸癌中 p14基因啟動(dòng)子過度甲基化與MSI關(guān)系密切,p14基因啟動(dòng)子過度甲基化的大腸癌更常表現(xiàn)為MSI-L,提示p14基因甲基化可能參與低微衛(wèi)星不穩(wěn)定性結(jié)直腸癌的發(fā)生和發(fā)展。

APC基因作為結(jié)直腸癌的“看門基因”,負(fù)責(zé)大腸上皮細(xì)胞的自穩(wěn)定,是結(jié)直腸癌發(fā)生的限速因子,家族性腺瘤性息肉病(fam ilial adenomatous polyposis,FAP)便是該基因突變或丟失引起的,同時(shí)在無家族史的結(jié)直腸癌患者中 35%～60%也存在該基因的丟失。除了基因的改變外,APC基因啟動(dòng)子高甲基化導(dǎo)致的失活在人類腫瘤中也很常見。Arnold等[6]發(fā)現(xiàn),染色體 5q上發(fā)生 LOH并且 APC表達(dá)降低的散發(fā)性結(jié)直腸癌病例,其APC啟動(dòng)子發(fā)生高甲基化的頻率明顯高于染色體 5q上發(fā)生LOH但APC表達(dá)正常的病例。目前認(rèn)為,與 5q雜合性丟失相比較,APC啟動(dòng)子異常高甲基化在結(jié)直腸癌APC失活機(jī)制中可能起著“二次打擊”的作用。

RASSF1A基因是 Ras基因超家族的成員,發(fā)揮著抑癌基因的作用。2000年,Dammann在肺癌細(xì)胞中發(fā)現(xiàn) RASSF1基因。其后的研究表明 RASSF1A啟動(dòng)子甲基化導(dǎo)致的表達(dá)缺失與多種腫瘤的發(fā)生有關(guān)[7]。Wagner等[8]發(fā)現(xiàn),45%(13/29)的結(jié)直腸癌病例發(fā)生了 RASSF1A基因啟動(dòng)子甲基化,而其 3p21.3等位基因丟失卻并沒有檢測到。這表明RASSF1A基因啟動(dòng)子異常甲基化而失活在結(jié)直腸癌中是很常見的事件,目前認(rèn)為,RASSF1A的失活主要是因?yàn)閱?dòng)子的甲基化而非突變導(dǎo)致。

E-cadherin(上皮鈣黏素)存在于正常細(xì)胞膜表面,是調(diào)節(jié)細(xì)胞與細(xì)胞,細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)之間黏附反應(yīng)的重要媒介,在大多數(shù)腫瘤組織中則低表達(dá)或失表達(dá),與腫瘤的侵襲有著密切的關(guān)系,造成E-cadherin表達(dá)降低的主要原因是其基因CDH 1啟動(dòng)子 CpG島的高甲基化。Wheeler等[9]應(yīng)用甲基化特異性 PcR法檢測 28例結(jié)腸癌上皮鈣黏素基因啟動(dòng)子區(qū) CpG島甲基化狀況,發(fā)現(xiàn) 46%發(fā)生了甲基化,基因啟動(dòng)子甲基化與上皮鈣黏素表達(dá)降低顯著相關(guān)。目前的研究表明,E-cadherin還能與 βcatenin在細(xì)胞膜上形成 E-cadherin/β-catenin復(fù)合體,通過結(jié)合β-catenin阻止其進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)從而阻斷其對(duì)下游靶基因的激活而抑制細(xì)胞生長和增殖,并促進(jìn)細(xì)胞的凋亡[10]。

1.2 組蛋白修飾與結(jié)直腸癌

真核細(xì)胞的基因組DNA在細(xì)胞核里是以染色質(zhì)存在的,染色質(zhì)是由 DNA、組蛋白、非組蛋白及少量的 RNA組成。組蛋白的 N-末端可通過乙酰化、甲基化、磷酸化、泛素化等進(jìn)行翻譯后修飾,不同的組蛋白 N-末端有不同的氨基酸(如組蛋白 H 3末端含 7個(gè) Lys和 2個(gè) Ser,H 4末端含 5個(gè) Lys和 1個(gè) Ser),組蛋白的任何 1種修飾都有可能改變組蛋白和各種染色質(zhì)相關(guān)蛋白的親合力,影響核小體、染色質(zhì)的高級(jí)結(jié)構(gòu),進(jìn)而影響基因的轉(zhuǎn)錄。其中以乙酰化和甲基化修飾尤為重要。

1.2.1 組蛋白乙?；?組蛋白乙?；墙M蛋白修飾中研究最多、最透徹的,乙酞化修飾大多位于組蛋白H 3中的第 9,14,18,23位賴氨酸,組蛋白乙?；怯山M蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶(histone acetyltransferase,HAT)或組蛋白去乙酰化酶(histone deacetylase,HDAC)共同介導(dǎo)的 1個(gè)可逆的動(dòng)態(tài)平衡過程。HAT的作用是將乙酰輔酶 A的乙?；D(zhuǎn)移到核心組蛋白N-末端特定賴氨酸殘基上,消除了氨基酸殘基所帶的正電荷,使DNA構(gòu)象展開、核小體結(jié)構(gòu)松弛,從而促進(jìn)轉(zhuǎn)錄因子和協(xié)同轉(zhuǎn)錄因子與 DNA結(jié)合,激活特定基因的轉(zhuǎn)錄;而HDAC則是去除賴氨酸殘基上乙酰基的作用,恢復(fù)組蛋白的正電性,增加組蛋白與帶負(fù)電的DNA間的吸引力,從而阻止轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件靠近啟動(dòng)子而達(dá)到抑制基因轉(zhuǎn)錄的作用[11]。組蛋白的這種乙?；c去乙酰化的動(dòng)態(tài)失衡將會(huì)影響基因轉(zhuǎn)錄水平,從而影響細(xì)胞的分裂、分化與凋亡,在惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展中可能起著重要作用。在人結(jié)腸癌細(xì)胞系 SW 1116和人直腸癌細(xì)胞系 Colo-320中,HDAC抑制劑曲古抑菌素A(trichostatin A,TSA)和丁酸鈉通過抑制HDAC,增強(qiáng)乙酰化水平顯著上調(diào)p21WAF1基因的轉(zhuǎn)錄,其細(xì)胞周期亦被阻滯于G1期[12]。粗纖維食物可降低結(jié)直腸癌的發(fā)生率原因可能與其中大量的丁酸鹽等短鏈脂肪酸上調(diào)p 21WAF1等抑癌基因啟動(dòng)子區(qū)相關(guān)的染色體組蛋白乙?；兄匾P(guān)系。

1.2.2 組蛋白甲基化 組蛋白甲基化修飾是重要的組蛋白修飾機(jī)制,它被認(rèn)為是染色質(zhì)是否具有活性的標(biāo)志。甲基化修飾的部位主要是組蛋白H 3和H 4的賴氨酸和精氨酸兩類殘基,單個(gè)賴氨酸或精氨酸最多可被 3個(gè)甲基修飾。組蛋白甲基化和DNA甲基化可聯(lián)合作用共同參與抑癌基因沉默而誘發(fā)腫瘤。

p53基因是發(fā)現(xiàn)最早的抑癌基因之一,參與細(xì)胞周期調(diào)節(jié)、DNA修復(fù)、控制細(xì)胞增生和凋亡。p53功能缺陷的細(xì)胞不能誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡,也不能控制腫瘤細(xì)胞的生長。目前發(fā)現(xiàn)組蛋白賴氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶(histone lysine methyltransferases,HKMTs)Set9、Smyd2和 Set8能夠甲基化 p53蛋白而(抑制其活性)調(diào)節(jié)其功能。甲基化位點(diǎn)分別為 p53K 372、p53K 370和p53K 382[13～15]。同時(shí)研究發(fā)現(xiàn)組蛋白賴氨酸特異性去甲基化酶 1(lysine-specific demethylase 1,LSD 1)也能使 p53蛋白 K 370位點(diǎn)發(fā)生特異性去甲基化而抑制p 53的功能[16]。

1.2.3 組蛋白磷酸化 組蛋白的磷酸化修飾主要參與細(xì)胞信號(hào)通路的活化。ERK-MAPK途徑和p38-MAPK途徑的激活能引起組蛋白H 3的Ser-10磷酸化,Ser-10的磷酸化在真核生物的基因轉(zhuǎn)錄活化中起重要作用。ATM/ATR和 DNA-PK通路激活能夠引起組蛋白H 2A變異體 H 2AX的 Ser-139磷酸化,后者參與DNA損傷的修復(fù)。

1.3 基因組印跡

基因組印跡是近年來發(fā)現(xiàn)的 1種不遵從孟德爾定律的,依靠單親傳遞某些遺傳學(xué)性狀的現(xiàn)象,即某些基因呈親源依賴性的單等位基因表達(dá),另一等位基因則不表達(dá),當(dāng)這些基因出現(xiàn)遺傳印跡丟失(LOI)時(shí)就會(huì)出現(xiàn) 2個(gè)等位基因的同時(shí)表達(dá)導(dǎo)致腫瘤發(fā)生,葡萄胎和畸胎瘤就是遺傳印跡丟失引起的腫瘤。在對(duì)基因組印跡的研究發(fā)現(xiàn)胰島素樣生長因子Ⅱ(IGF2)基因印跡丟失在結(jié)直腸癌的發(fā)生中有著重要的意義。IGF2屬于癌基因,是第 1個(gè)被證實(shí)的內(nèi)源性印跡基因,IGF2基因具有促生長的作用,當(dāng)其發(fā)生基因印跡丟失而使雙等位基因同時(shí)表達(dá)時(shí)就會(huì)促成腫瘤細(xì)胞的異常生長。Cui[17]的研究指出 IGF-ⅡLOI在結(jié)直腸腫瘤的早期診斷、預(yù)防及療效監(jiān)測方面具有重要意義,可作為結(jié)直腸癌發(fā)生危險(xiǎn)性的分子標(biāo)記物。

2 表觀遺傳學(xué)在結(jié)直腸癌中的應(yīng)用

2.1 表觀遺傳學(xué)在腫瘤早期診斷中的應(yīng)用

由于表觀遺傳學(xué)可以將DNA、RNA以及蛋白表達(dá)等各個(gè)層面完整有機(jī)地結(jié)合在一起,通過對(duì)表觀遺傳學(xué)改變進(jìn)行監(jiān)測,可以對(duì)腫瘤的發(fā)生進(jìn)行預(yù)測和診斷。目前應(yīng)用較多的是對(duì)腫瘤DNA甲基化異常的檢測,這是因?yàn)?與 DNA變異相比,基因甲基化改變常是細(xì)胞癌變過程中更為早期的事件,因此可能在腫瘤早期診斷中具有更大的價(jià)值。甲基化特異性PCR(MSP)是目前檢測基因啟動(dòng)子 CpG島甲基化中應(yīng)用最廣泛的 1種技術(shù),它是利用經(jīng)重亞硫酸鈉處理后 DNA序列中甲基化和未甲基化CpG島的差異,然后設(shè)計(jì)出用于甲基化分析的特異性 PCR引物來進(jìn)行檢測。大多數(shù)腫瘤都有多個(gè)獨(dú)立的啟動(dòng)子甲基化事件,因此建立合理的多指標(biāo)甲基化圖譜能為腫瘤風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估、早期診斷以及腫瘤預(yù)后提供有用的信息。Leung等[18]發(fā)現(xiàn)檢測糞便中7個(gè)基因(APC、ATM、hMLH 1、SFRP2、 HLTF、MGMT和 GSTP1)的甲基化診斷大腸癌和腺瘤的敏感度分別為 75%和 68%,特異度為 90%。

2.2 表觀遺傳學(xué)在腫瘤治療中的應(yīng)用

與遺傳學(xué)改變不同,表觀遺傳學(xué)改變是可逆的,通過糾正表觀遺傳改變?yōu)槟[瘤的治療提供了個(gè)新的途徑,使其成為潛在的腫瘤治療靶點(diǎn)。大量研究表明 DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶抑制劑和組蛋白去乙?；敢种苿?duì)腫瘤具有明顯的治療作用,但由于缺乏特異性和一定的毒副作用在臨床運(yùn)用上仍需進(jìn)一步研究[19]。不過表觀遺傳學(xué)引起的基因功能異常存在多種機(jī)制且相互作用,也提示聯(lián)合治療可能將是個(gè)很好的治療策略[20]。

總之,表觀遺傳學(xué)的研究使我們對(duì)結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展不再拘泥于基因水平的改變?；蚝笮揎椀漠惓Ｔ谀[瘤的發(fā)生、發(fā)展中可能具有更為普遍和重要的作用。相信隨著對(duì)其機(jī)制的進(jìn)一步闡明,表觀遺傳學(xué)將為研究結(jié)直腸癌的發(fā)病機(jī)制提供更開闊的思路,并在結(jié)直腸癌的診斷、治療和預(yù)防等多方面發(fā)揮極為重要的作用。

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