微生物生產(chǎn)功能性油酯-共軛亞油酸的研究進(jìn)展

羅玉芬,徐爾尼,巫小丹

(南昌大學(xué)食品科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江西南昌 330031)

微生物生產(chǎn)功能性油酯-共軛亞油酸的研究進(jìn)展

羅玉芬,徐爾尼,巫小丹

(南昌大學(xué)食品科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江西南昌 330031)

共軛亞油酸是一種功能性油脂,具有抗癌、抗動(dòng)脈粥樣硬化、減肥、促進(jìn)生長(zhǎng)、改善免疫功能等許多重要生理功能,在醫(yī)藥、食品、保健品、化妝品等中具有廣闊的應(yīng)用前景。本文系統(tǒng)地綜述了可轉(zhuǎn)化生成共軛亞油酸的微生物菌株、影響轉(zhuǎn)化的因素以及共軛亞油的提取、純化和檢測(cè)方面的研究進(jìn)展。

共軛亞油酸,微生物轉(zhuǎn)化,提取

共軛亞油酸 (Conjugated linoleic acid,CLA)是一類具有多種生物學(xué)功能的多不飽和脂肪酸,主要存在于奶制品及反芻動(dòng)物肉制品中,是一種天然活性物質(zhì)。大量的科學(xué)研究證明,共軛亞油酸具有抗腫瘤、抗氧化、抗動(dòng)脈粥樣硬化、提高免疫力、提高骨骼密度、防治糖尿病等多種重要生理功能;還能降低動(dòng)物和人體膽固醇以及甘油三酯和低密度脂蛋白膽固醇,降低動(dòng)物和人體脂肪,增加肌肉。因此,共軛亞油酸成為目前藥物開發(fā)、食品添加和動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)等領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。

1 共軛亞油酸的發(fā)現(xiàn)與功能研究

共軛亞油酸 (CLA)是存在于食物中的天然成分,Booth等 (1935)首次證明反芻動(dòng)物食品中含有共軛雙鍵的脂肪酸。1951年,P.L.Nichols等成功合成了共軛亞油酸 (CLA)。1966年,C.R.Kepler發(fā)現(xiàn) c9, t11-CLA是反芻動(dòng)物瘤胃內(nèi)溶纖維丁酸弧菌氫化亞油酸過程中的中間體。1978年,M ichael Pariza在烹調(diào)過程中尋找肉中誘導(dǎo)有機(jī)體突變物質(zhì)的形成時(shí)發(fā)現(xiàn) CLA具有抑制誘變活性,并推測(cè)其抑制誘變活性能抑制癌癥的發(fā)生。1985年,Pariza發(fā)現(xiàn) CLA能降低小鼠皮膚癌的發(fā)病率;1990年,Y.L.Ha等確認(rèn) CLA對(duì)苯并芘誘導(dǎo)老鼠前胃腫瘤的形成有抑制作用。1991年,C.I p發(fā)現(xiàn) CLA具有抑制老鼠乳腺癌的生成。20世紀(jì) 90年代中期 CLA的抗腫瘤特性得到了實(shí)驗(yàn)證實(shí),由此引發(fā)了人們對(duì) CLA的極大研究興趣。1997年,Pariza小組發(fā)現(xiàn),CLA能顯著減少身體內(nèi)的脂肪,并增加瘦肉的量。1999年,日本油脂公司建立了世界上第一家 CLA生產(chǎn)裝置,CLA減肥膠囊 (營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充劑)在美國(guó)上市。2002年,CLA列入列為我國(guó)“十五”國(guó)家重大科技專項(xiàng)——奶?，F(xiàn)代集約飼養(yǎng)關(guān)鍵技術(shù)研究與產(chǎn)業(yè)化開發(fā)項(xiàng)目。2003年,Tonalin CLA減肥膠囊在我國(guó)試銷。大量的醫(yī)學(xué)研究證明, CLA具有抵抗癌癥,減少脂肪沉積,防止動(dòng)脈粥樣硬化,加強(qiáng)免疫系統(tǒng)功能的作用。CLA對(duì)改善動(dòng)物機(jī)體代謝,重新分配營(yíng)養(yǎng)素,增加瘦肉率,改善肉品質(zhì),提高動(dòng)物免疫系統(tǒng)功能有明顯效果。CLA正成為灸手可熱的保健食品和促生長(zhǎng)營(yíng)養(yǎng)劑。

2 共軛亞油酸的結(jié)構(gòu)

共軛亞油酸 (CLA)是指一系列含有共軛雙鍵、具有位置和空間構(gòu)型不同的十八碳二烯酸同分異構(gòu)體的混合物。CLA的異構(gòu)體十分豐富,從 2,4碳原子到 15,17碳原子有 14種可能的位置異構(gòu)體,但其主要位置異構(gòu)體有 4種,即:C8,C10;C9,C11;C10,C12和 C11,C13,而每種位置異構(gòu)體又有 4種幾何異構(gòu)體即: cc,ct,tc和 tt,其中 c9,t11和 t10,c12兩種異構(gòu)體被證實(shí)具有很強(qiáng)的生理活性[1]。

3 微生物法生產(chǎn)共軛亞油酸

利用化學(xué)法如油酸烯丙醇脫水,亞油酸堿性異構(gòu)化等都可以合成 CLA,不過產(chǎn)物是各種 CLA異構(gòu)體的混合物。工業(yè)上目前主要是采用堿法異構(gòu)化使亞油酸(LA)發(fā)生異構(gòu)化而生成 CLA,其缺點(diǎn)是需要在堿性條件、高溫和一定的壓力下進(jìn)行異構(gòu)化反應(yīng),所得到的產(chǎn)物也是一系列 CLA位置和幾何異構(gòu)體的混合物,活性異構(gòu)體 c9,t11-18∶2和 t10,c12-18∶2 CLA的含量低。此外,化學(xué)合成產(chǎn)物中的 t,t異構(gòu)體對(duì)人體有害。由于化學(xué)合成法具有以上一些弊病,影響了合成產(chǎn)物的應(yīng)用范圍,因此,科學(xué)家們開始致力于生物合成CLA的研究。

許多微生物能夠利用自身的酶將 LA轉(zhuǎn)化成CLA。與化學(xué)合成法相比,利用微生物合成 CLA的特異性強(qiáng),條件也非常溫和,產(chǎn)物中活性 CLA異構(gòu)體含量高,與天然食物中 CLA異構(gòu)體組成相似,無毒副作用,有利于產(chǎn)品的開發(fā)應(yīng)用。因此利用微生物生產(chǎn)CLA已成為該領(lǐng)域的發(fā)展方向。

3.1 生產(chǎn)共軛亞油酸的微生物

3.1.1 瘤胃菌 天然 CLA主要來自瘤胃細(xì)菌對(duì)亞油酸異構(gòu)化作用及內(nèi)源合成。Kepler等[2]發(fā)現(xiàn),c9, t11-CLA是反芻動(dòng)物瘤胃中厭氧溶纖維丁酸弧菌(B utyrivibrio fibrisolvens)生物氫化LA過程的中間體。Ki m等[3]從飼喂谷物的奶牛瘤胃中取樣,經(jīng)乳酸鹽和胰蛋白胨富集培養(yǎng),分離到能產(chǎn)生 t10,c12-CLA的埃氏巨型球菌 (M egasphaera elsdenii)。

雖然多種瘤胃菌均能催化LA轉(zhuǎn)化成 CLA,但瘤胃菌的培養(yǎng)需要嚴(yán)格的厭氧條件,且生成的產(chǎn)物是以 c9,t11-CLA為主的CLA的混合物,異構(gòu)體含量復(fù)雜,生成的 CLA在其它微生物存在下還可以發(fā)生氧化、還原等反應(yīng)轉(zhuǎn)化成其它脂肪酸,因此限制了在生產(chǎn)上的應(yīng)用。

3.1.2 乳酸菌 乳酸菌是一群能從可發(fā)酵性碳水化合物中產(chǎn)生大量乳酸的革蘭氏陽性細(xì)菌的通稱,廣泛存在于人、畜、禽腸道及多種食品中。乳酸菌兼性厭氧,培養(yǎng)條件易于控制,無毒安全。迄今,人們發(fā)現(xiàn)多種乳酸菌菌種可以發(fā)酵生產(chǎn) CLA,乳酸菌中含有亞油酸異構(gòu)酶,這是一種誘導(dǎo)酶,作用位點(diǎn)在脂肪酸的 c12雙鍵上,能把LA轉(zhuǎn)化為 c9,t11-CLA。空氣對(duì)它沒有影響,而有雙鍵在 c6上的脂肪酸會(huì)抑制其活性,但有雙鍵在 c9位置上的脂肪酸可提高其活性,得到的 CLA可直接從細(xì)胞培養(yǎng)液中提取。Ogawa等[4]報(bào)道,嗜酸乳桿菌 AKU1137(Lactobacillus acidophilusAKU1137)在微好氧的環(huán)境下,可將 LA轉(zhuǎn)化為 CLA。實(shí)驗(yàn)表明,反應(yīng)進(jìn)行 4d后,95%的LA被轉(zhuǎn)化為CLA。隨后,Ogawa等又篩選到1株更有效的植物乳酸菌 AKU1009a(Lactobacillus plantarum AKU1009a),在最優(yōu)條件下,以含 12%的 LA為底物經(jīng) 108h,CLA產(chǎn)量可達(dá) 40mg/mL。AKU1009a菌株在脂肪酶存在下,還能轉(zhuǎn)化蓖麻油合成 CLA。張中義等[5]從泡菜中篩選的一株具有較高轉(zhuǎn)化能力的植物乳桿菌 ZS2058(Lactobacillus plantarumZS2058),在LA質(zhì)量濃度為 1.204 mg/mL的條件下于 37℃培養(yǎng) 24 h,能將 11.6%的LA轉(zhuǎn)化為 c9,t11-18∶2(質(zhì)量分?jǐn)?shù) 75.9%)和 t10,cl2-18∶2(質(zhì)量分?jǐn)?shù) 24.1%)異構(gòu)體。 Ir mak等[6]對(duì) 嗜 酸 乳 桿 菌 (Lactobacillus acidophilus)、羅 伊 氏 乳 酸 桿 菌 ATCC23272 (Lactobacillus reuteriATCC 23272)和羅伊氏乳酸桿菌ATCC55739(Lactobacillus reuteri ATCC55739)進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn),這3種菌都有將LA轉(zhuǎn)化為CLA的能力。產(chǎn)量最高的是羅伊氏乳酸桿菌 ATCC55739。杜波等[7]首次自青貯飼料中分離篩選到一株植物乳酸菌ANCLA01(Lactobacillus plantarumANCLA01),能將濃度為 1mg/mL的 LA轉(zhuǎn)化生成 33.44μg/mL的CLA。

3.1.3 丙酸菌 丙酸菌存在于牛奶、干酪及其它乳制品青貯飼料、土壤和家畜糞便中,丙酸菌中的某些菌種也可以產(chǎn)生 CLA。Jiang[8]的研究表明,費(fèi)氏丙酸桿菌 (Propionibacterium frudenreichii)能將游離 LA轉(zhuǎn)化成 CLA。他們采用MRS培養(yǎng)基作為初選培養(yǎng)基,檢測(cè)了 19株丙酸菌轉(zhuǎn)化LA為 CLA的能力。結(jié)果發(fā)現(xiàn),有 3株丙酸菌 (PFF、PFF6、PFS)具有轉(zhuǎn)化生成 CLA的能力,產(chǎn)量達(dá) 265μg/mL。并且,丙酸菌可將LA轉(zhuǎn)化成胞外 CLA。Rainio[9]對(duì)費(fèi)氏丙酸桿菌研究發(fā)現(xiàn),在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期 CLA形成量最多,有80%～87%的 LA轉(zhuǎn)化成 CLA,其中 c9,t11-CLA占85%～95%。

3.1.4 共軛亞油酸高產(chǎn)菌的誘變育種 于國(guó)萍等[10]以紫外線、硫酸二乙酯、亞硝基胍進(jìn)行多次及復(fù)合誘變處理,提高了德氏乳桿菌保加利亞亞種 Ldb2 (Lactobacillus.delbrueckiisubspbulgaricusLdb2)生成CLA的能力,最終獲得了 315UU,98DD及 71UN 3株突變菌,使 CLA的生成能力較出發(fā)菌株提高幅度在43.04%～59.56%之間。并且指出,誘變劑的一次處理對(duì)菌株Ldb2提高 CLA的生成能力是有限的。而反復(fù)多次處理,尤其是一種誘變劑大劑量或兩種誘變劑連續(xù)處理,對(duì)提高 CLA的生成能力效果更好。王璟等[10]以植物乳酸菌 A(Lactobacillus plantarumA)為出發(fā)菌株,經(jīng)紫外線、硫酸二乙酯的依次處理,結(jié)合高濃度亞油酸平板 (0.1%)的篩選和進(jìn)一步搖瓶復(fù)篩,得到一株 CLA高產(chǎn)菌株Lactobacillus plantarum H3-1,其共軛亞油酸產(chǎn)量高達(dá) 30.67mg/L,比出發(fā)菌株提高了 264.5%。

3.2 影響微生物轉(zhuǎn)化生成共軛亞油酸的因素

微生物轉(zhuǎn)化 LA生成 CLA受到各種因素的影響,包括菌種、培養(yǎng)基、細(xì)胞培養(yǎng)方式、底物(LA)的濃度、菌濃度、pH、培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時(shí)間等。

3.2.1 培養(yǎng)基對(duì)轉(zhuǎn)化生成共軛亞油酸的影響 在不同培養(yǎng)基上 CLA生產(chǎn)菌株的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)化能力有所不同。Alonso等[12]分析了嗜酸乳桿菌 (Lactobacillus acidophilus)和干酪乳桿菌 (Lactobacillus casei)在MRS或脫脂乳培養(yǎng)基中生產(chǎn) c9,t11-/t10,c12-/t9, t11-CLA異構(gòu)體以及總 CLA的狀況。結(jié)果表明,菌株在MRS培養(yǎng)基中的LA轉(zhuǎn)化率比在脫脂乳培養(yǎng)基中高。Niu等[13]對(duì)植物乳桿菌 ZS2058(Lactobacillus plantarumZS2058)進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn),在含有 0.5mg/mL亞油酸的MRS培養(yǎng)基培養(yǎng)時(shí),轉(zhuǎn)化生成的 CLA中, c9,t11-CLA占 96.4%。王麗敏等[14]研究費(fèi)氏丙酸桿菌費(fèi)氏亞種 (P.freudenreichiisubspfreudenreichii),發(fā)現(xiàn)其在MRS,乳酸鈉和脫脂乳 3種培養(yǎng)基質(zhì)中均具轉(zhuǎn)化葵花籽油生成 CLA的能力,但是 CLA產(chǎn)量在這三種培養(yǎng)基的順序?yàn)镸RS>乳酸鈉 >脫脂乳。

3.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)方式對(duì)轉(zhuǎn)化生成共軛亞油酸的影響

在發(fā)酵過程的控制中,一方面要考慮菌體的最適生長(zhǎng)條件,另一方面要考慮亞油酸異構(gòu)酶的合成及酶活的最佳條件,所以選擇合適的細(xì)胞培養(yǎng)方式至關(guān)重要。Martin等[15]利用混合碳源進(jìn)行反芻動(dòng)物瘤胃細(xì)菌的連續(xù)培養(yǎng),在培養(yǎng)的 24～30h期間,c9, t11-CLA產(chǎn)率較高。當(dāng)稀釋速率控制在 0.05h-1時(shí), CLA產(chǎn)率下降。梁新樂等[16]對(duì)費(fèi)氏丙酸桿菌 HZ-P -35(Propionibacterium freudenreichiiHZ-P-35)高密度培養(yǎng)轉(zhuǎn)化亞油酸生成共軛亞油酸進(jìn)行了研究,分別采用間歇培養(yǎng)、pH-sat培養(yǎng)、間歇補(bǔ)料培養(yǎng)和連續(xù)補(bǔ)料培養(yǎng)四種培養(yǎng)方式進(jìn)行細(xì)胞高密度培養(yǎng)。相對(duì)于間歇培養(yǎng),pH-sat培養(yǎng)細(xì)胞干重是它的 1.5倍,間歇補(bǔ)料培養(yǎng)和連續(xù)補(bǔ)料培養(yǎng)的細(xì)胞干重分別是它的3.4倍和 2.97倍。而連續(xù)補(bǔ)料培養(yǎng)時(shí)的 CLA產(chǎn)量最高,是間歇培養(yǎng) CLA產(chǎn)量的 1.29倍。因此認(rèn)為間歇補(bǔ)料培養(yǎng)較有利于細(xì)胞高密度培養(yǎng),而連續(xù)補(bǔ)料培養(yǎng)較有利于CLA的產(chǎn)生。

Lee等[17]將羅伊氏乳桿 菌 ATCC 55739 (Lactobacillus reuteriATCC 55739)固定在硅膠上,在最適條件下反應(yīng) 1h,500mg/L的 LA可轉(zhuǎn)化生成175mg/L的 CLA,轉(zhuǎn)化率為 35%。而游離洗滌細(xì)胞在最適條件下反應(yīng) 1h,僅產(chǎn)生 32mg/L的 CLA,轉(zhuǎn)化率為 6.4%。固定化細(xì)胞 CLA轉(zhuǎn)化率是游離洗滌細(xì)胞的 5.5倍。王歡等[18]研究了以海藻酸鈉為載體,采用包埋法制備固定化干酪乳桿菌 (Lactobacillus casei)的相關(guān)條件對(duì) CLA生成量的影響,在最適條件下培養(yǎng) 18h,CLA積累量可達(dá)到最大值 62.57μg/mL。而游離乳酸菌在相同條件下培養(yǎng) 18h,CLA積累量?jī)H為50μg/mL。在游離乳酸菌與固定化乳酸菌均達(dá)到最大產(chǎn)量的 CLA時(shí),固定化的乳酸菌比游離菌所用時(shí)間短,且 CLA積累量多,說明細(xì)胞固定化更有利于實(shí)現(xiàn)高產(chǎn)量的連續(xù)化作業(yè),便于今后的工業(yè)化生產(chǎn)。

3.2.3 亞油酸濃度對(duì)轉(zhuǎn)化生成共軛亞油酸的影響CLA是亞油酸異構(gòu)酶異構(gòu)化LA形成的產(chǎn)物,因此底物L(fēng)A的濃度是決定 CLA形成的主要因素之一。底物L(fēng)A濃度的提高,既有利于提高產(chǎn)物 CLA的濃度,也有利于提高 CLA的生成速率,但生產(chǎn)菌株對(duì) LA的耐受性也存在一定的范圍。LA濃度過高會(huì)抑制菌株的生長(zhǎng),從而使CLA的產(chǎn)量下降。因此底物L(fēng)A存在一個(gè)最適宜的濃度范圍。Kishino[19]從 14株乳酸菌中篩選到一株能將LA轉(zhuǎn)化成 CLA的植物乳桿菌 AKU1009a(Lactobacillus plantarumAKU1009a),在含 0.06%LA的培養(yǎng)基上培養(yǎng)并收集菌體,在含 12%的LA的反應(yīng)液中反應(yīng) 108h,每毫升反應(yīng)液生成40mg的 CLA,CLA的產(chǎn)率為 33%;在含 2.6%的LA的反應(yīng)液中反應(yīng) 96h,每毫升反應(yīng)液生成 20mg的CLA,CLA的產(chǎn)率為 80%。陸永霞等[20]用嗜酸乳桿菌 (Lactobacillus acidophilus)在 MRS培養(yǎng)基中轉(zhuǎn)化LA生成 CLA,反應(yīng) pH4.6、溫度 37℃、接種量 2.0%、反應(yīng)時(shí)間 24h,當(dāng)LA的添加量為 0～0.025%時(shí),CLA的產(chǎn)量隨之增加,但繼續(xù)增加 LA濃度時(shí),CLA的產(chǎn)量下降。

3.2.4 發(fā)酵條件對(duì)轉(zhuǎn)化生成共軛亞油酸的影響 微生物菌株發(fā)酵的 pH、溫度、時(shí)間等條件都會(huì)影響細(xì)胞內(nèi)亞油酸異構(gòu)酶的活性,從而影響其對(duì)LA進(jìn)行轉(zhuǎn)化。曹健等[21]研究表明嗜酸乳桿菌 1.1854 (Lactobacillus acidophilus1.1854)突變株的亞油酸異構(gòu)酶轉(zhuǎn)化 LA為 CLA的最佳條件為:pH4.0,溫度35℃,保溫時(shí)間 48h,在此條件下,CLA的轉(zhuǎn)化率最高,達(dá) 38.1%。董明等[22]以鹽生植物紫花苜蓿籽油為底物,用嗜酸乳酸桿菌 1.1854 (Lactobacillus acidophilus1.1854)催化紫花苜蓿籽油中的 LA轉(zhuǎn)化為 CLA,用磷酸鈉緩沖液調(diào)節(jié)發(fā)酵培養(yǎng)基的 pH,研究 pH對(duì)生產(chǎn)CLA的影響,當(dāng)pH 6.4時(shí),CLA轉(zhuǎn)化率最高,超過50%。

過低的溫度不利于菌種的生長(zhǎng),導(dǎo)致菌體產(chǎn)酶的生化反應(yīng)不能順利進(jìn)行;而過高的溫度會(huì)加速酶的變性而使該酶失活。董明等[23]以鹽生植物紫花苜蓿的種籽油為底物,用植物乳桿菌 6026(Lactobacillus plantarum6026)催化紫花苜蓿籽油中的 LA轉(zhuǎn)化為CLA。在該乳酸菌發(fā)酵過程中改變發(fā)酵溫度,發(fā)現(xiàn)CLA轉(zhuǎn)化率會(huì)有較明顯的變化。在 20℃時(shí),CLA轉(zhuǎn)化率不到 10%;隨著溫度升高至 37℃,CLA轉(zhuǎn)化率也隨之升高到 30%;而當(dāng)溫度繼續(xù)升高到 50℃,CLA轉(zhuǎn)化率呈下降趨勢(shì)。分析認(rèn)為乳桿菌中的亞油酸異構(gòu)化酶的最適溫度在 37℃,所以溫度在 37℃時(shí) CLA轉(zhuǎn)化率最大。培養(yǎng)時(shí)間對(duì)LA的轉(zhuǎn)化也有很大影響,植物乳桿菌培養(yǎng)至 5～10h時(shí)為對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,此期間生物量快速增加;約 12h進(jìn)入穩(wěn)定期,CLA轉(zhuǎn)化率此時(shí)呈高速增長(zhǎng)階段;約 21h時(shí),CLA轉(zhuǎn)化率達(dá)到最大,而后 CLA轉(zhuǎn)化率呈下降趨勢(shì),可能是由于 CLA不穩(wěn)定,須進(jìn)行保護(hù)以防止其氧化[24]。

4 共軛亞油酸的提取和純化

4.1 共軛亞油酸的提取

Rainio[9]對(duì) 費(fèi) 氏 丙 酸 桿 菌 DS M7067 (Propionibacterium freudenreichiiDS M7067)研究發(fā)現(xiàn), 98%的 CLA存在于胞外。趙建新等[25]研究了植物乳桿菌 ZS2058(Lactobacillus plantarumZS2058)轉(zhuǎn)化LA為 CLA的條件,培養(yǎng) 24h后,培養(yǎng)液中的 CLA遠(yuǎn)大于胞內(nèi)的含量,說明亞油酸異構(gòu)酶轉(zhuǎn)化 LA為 CLA后,CLA被分泌到胞外,因此可采用有機(jī)溶劑萃取法從發(fā)酵液中提取。

胡國(guó)慶等[26]研究植物乳桿菌 ZS2058 (Lactobacillus plantarumZS2058)在不同基質(zhì)中轉(zhuǎn)化生成CLA的情況,采用的 CLA的提取方法為:取發(fā)酵液1mL,溶解于2mL的異丙醇,然后添加1.5mL的正己烷,在旋渦震蕩器上混勻 3min,6000r/min, 10min離心,吸取上清液,添加 1mL水,6000r/min,離心 5min,吸取上清液,N2吹干。苗士達(dá)等[27]研究一株植物乳桿菌LT2-6(Lactobacillus plantarumLT2-6)轉(zhuǎn)化生產(chǎn) CLA的特性。采用的 CLA的提取方法為:向發(fā)酵液中加人 5倍體積的氯仿甲醇混合物 (氯仿 /甲醇 =2∶1,v/v)振蕩萃取,收集下層部分,離心,用無水硫酸鈉干燥,然后 30℃下蒸發(fā)除去溶劑,將殘余物移入螺帽小試管中,用氮?dú)獯蹈?。YuraweczM.P等[28]研究 CLA穩(wěn)定性時(shí)發(fā)現(xiàn),CLA在空氣中很快氧化分解成呋喃脂肪酸。所以提取 CLA時(shí)應(yīng)防止其氧化。楊得坡等[29]研究共軛亞油酸的抗氧化活性并篩選對(duì)其活性有保護(hù)作用的抗氧化劑。結(jié)果表明: TBHQ、TPP、BHA、BHT和α-硫辛酸對(duì) CLA都有一定保護(hù)作用,其中 TBHQ與茶多酚抗氧化性能效果顯著,TBHQ的添加量建議采用 0.01%～0.04%。

4.2 共軛亞油酸的純化

由于提取的CLA產(chǎn)物中還混有一些飽和脂肪酸和單不飽和脂肪酸及一些不可知的皂化物質(zhì),如果將其直接應(yīng)用于食品或飼料中,可能存在安全隱患。所以需要對(duì)CLA進(jìn)行純化。

4.2.1 利用脂肪酶的特異性進(jìn)行純化 利用脂肪酶特異性催化水解、轉(zhuǎn)酯和酯化反應(yīng)的特性,能把很難分離的共軛亞油酸酯異構(gòu)體分開。楊麗華等[30]利用假絲酵母脂肪酶兩步選擇性酯化,最佳反應(yīng)條件:等摩爾量的月桂醇和含有 2種 CLA異構(gòu)體 (c9, t11-CLA和 t10,c12-CLA)的游離脂酸,20%水, 20U/g假絲酵母脂肪酶,30℃下反應(yīng) 16h并伴隨攪拌。能提高 c9,t11-CLA異構(gòu)體的含量到 85.1%。并且采用分子蒸餾裝置來分離純化大量樣品,最后得到純度 92.2%的 c9,t11-CLA。

4.2.2 低溫結(jié)晶純化 在干冰浴條件下進(jìn)行(-58℃),在丙酮溶液中 t10,c12-共軛亞油酸甲酯會(huì)沉淀下來,而 c9,t11-共軛亞油酸甲酯仍保留在丙酮溶液中,因此可將兩者分開。但是用此法得到的產(chǎn)品的純度不是很高。

4.2.3 利用尿素進(jìn)行結(jié)晶純化 在鹽酸存在下,由于尿素能與結(jié)構(gòu)線性較好的共軛亞油酸酯加成形成結(jié)晶,而線性較差的共軛亞油酸酯仍留在溶液中,故可利用尿素分離共軛亞油酸甲酯混合物。尿素/共軛亞油酸甲酯重量比為 1∶1時(shí),t9,t11-CLA及 c9, c11-CLA形成結(jié)晶加成物被除去,而 c9,t11-CLA留在母液中,其純度提高到 75%;再用尿素進(jìn)行結(jié)晶,可除去大部分 c9,c11-CLA,c9,t11-CLA的純度可提高到 83%[31]。劉麗等[32]通過條件的優(yōu)化,得到尿素純化 CLA的最佳工藝條件:CLA粗品/尿素/甲醇=1∶2.5∶8,溫度-15℃,時(shí)間 6h,CLA純度由 70%提高到93.6%。

5 共軛亞油酸的分析和檢測(cè)

在CLA的分析中所采用的方法主要有紫外吸收光譜法、紅外吸收光譜法、薄層層析法、氣相色譜法、Ag+高效液相色譜法 (Ag+-HPLC)。

5.1 光譜分析

5.1.1 紫外吸收光譜法 含共軛雙鍵脂肪酸的吸收區(qū)在 230～235nm附近,CLA的特征吸收峰在 234nm附近。據(jù)朗伯-比爾定律,CLA樣品在 234nm處的吸收程度與其濃度呈線性相關(guān)。以 CLA標(biāo)準(zhǔn)品建立標(biāo)準(zhǔn)曲線及回歸方程,結(jié)合樣品在 234nm處的吸光度值,可計(jì)算得到樣品中 CLA各種異構(gòu)體的總含量,靈敏度為 10-7～10-4g/mL,準(zhǔn)確度較好,簡(jiǎn)便易行。此法能檢測(cè) CLA的總量,但不能檢測(cè)各異構(gòu)體的含量[33]。

5.1.2 紅外吸收光譜法 紅外光譜可根據(jù)光譜中吸收峰的位置和形狀來推斷未知物結(jié)構(gòu),依照特征吸收峰的強(qiáng)度測(cè)定各組分的含量,快速、高度靈敏,而且所需檢測(cè)試樣用量較少。CLA在紅外區(qū) 900～1000cm-1有吸收峰,如順反共軛在 985、950cm-1處有兩個(gè)吸收峰,可測(cè)出各種異構(gòu)體的含量,但該法對(duì)CLA異構(gòu)體的分離鑒定比較困難。

5.2 色譜分析

5.2.1 TLC分析法 在提純共軛脂肪酸時(shí),薄層層析法 (TLC法)常用作實(shí)現(xiàn)更進(jìn)一步分離的有效手段之一。應(yīng)用涂布有硝酸銀的 TLC二氧化硅凝膠盤作固定相[34],流動(dòng)相可選用甲苯、正己烷與二乙醚混合物、苯與正己烷混合物、苯與二乙醚混合物、苯與石油醚及二乙醚混合物等。雖然這種方法無法使得共軛脂肪酸的幾何異構(gòu)體徹底的分離,但重復(fù)操作可得到相對(duì)較為集中的同構(gòu)型共軛雙烯酸的幾何異構(gòu)體。

5.2.2 Ag+高效液相色譜法 Ag+高效液相色譜法(Ag+-HPLC)是利用Ag+對(duì) CLA的特異性吸附而將大部分 CLA異構(gòu)體分開,但該方法無法使 c9,c11異構(gòu)體與其他 9,11異構(gòu)體分開[35]。由于工業(yè)上生產(chǎn)的 CLA中僅含有 c/t,t/c結(jié)構(gòu)異構(gòu)體,故可用于 t9, c11及 c9,t11異構(gòu)體的分離,也可用于半制備 CLA。

5.2.3 氣相色譜法 氣相色譜法是根據(jù)固定相對(duì)樣品中各組分的不同吸附、溶解能力來進(jìn)行分離的,優(yōu)點(diǎn)是高選擇性、高靈敏度和高分離效率。氣相色譜法(GC)是脂肪酸分析常規(guī)的方法,但甲基化會(huì)導(dǎo)致CLA異構(gòu)體組成發(fā)生較大的變化,Yamasaki[36]研究發(fā)現(xiàn)一種用于共軛亞油酸氣譜檢測(cè)的酯化方法,即在二甲亞砜或二甲基甲酰胺存在下,用硫酸酯化可避免CLA異構(gòu)體之間的轉(zhuǎn)化。

5 問題與展望

在人類追求健康、渴望長(zhǎng)壽的今天,CLA無論是作為保健食品、功能食品,還是將來應(yīng)用于臨床,它的研究都具有重要的意義。天然 CLA主要存在于牛奶、羊奶、牛肉等瘤胃動(dòng)物來源的食品中,但含量很少。隨著人們的需求增加,CLA的大量生產(chǎn)勢(shì)在必行。而微生物發(fā)酵生產(chǎn) CLA因其具有異構(gòu)體單一、選擇性合成、條件溫和、產(chǎn)量大等優(yōu)勢(shì),越來越引起人們的重視,應(yīng)用前景廣闊。篩選高產(chǎn)菌株,提高CLA的產(chǎn)量,研究更好的發(fā)酵條件是亟待解決的問題。隨著人們對(duì)CLA研究的不斷深人,相信 CLA作為“21世紀(jì)的新型營(yíng)養(yǎng)素”,必將為人類的健康生活帶來福音。

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Study on the production of functional oil---conjugated linoleic acid by m icrobe

LUO Yu-fen,XU Er-n i,W U Xiao-dan
(The KeyLaboratory of Food Science ofMOE,NanchangUniversity,Nanchang 330031,China)

Conjuga ted linole ic ac id was a kind of func tiona l oil,which had m any b iolog ica l func tion such as antica rc inogenic,antia the rogenic,body-we ight reduc ing,g row th p rom oting,as we ll as i mm unity enhanc ing,so it had a w ide fie ld of app lica tion in m ed ic ine,food,hea lth ca re and cosm e tic indus try.The deve lopm ent of CLA by m ic rob ia l conve rs ion conce rning w ith s tra ins,the influences on m ic rob ia l conve rs ion,the extrac tion technique, p urifica tion and de tec tion m e thods of CLA we re reviewed.

conjuga ted linole ic ac id;m ic rob ia l conve rs ion;extrac tion

TS221

A

1002-0306(2010)05-0377-05

2009-04-16

羅玉芬(1985-),女,碩士研究生,研究方向:應(yīng)用微生物。