αs1-酪蛋白的IgG抗原決定簇的識別

牛奶過敏是嬰幼兒最常見食物過敏反應(yīng)之一，在歐美發(fā)達(dá)國家，嬰兒牛奶過敏發(fā)生率約為2%～7.5%[1]。牛奶過敏是由乳及乳制品中的過敏原蛋白引起的一種變態(tài)反應(yīng)，目前普遍認(rèn)為酪蛋白和β-乳球蛋白是主要的過敏原。αs1-酪蛋白是酪蛋白中最主要的一個(gè)過敏原，凡是對酪蛋白過敏的人，基本上都對αs1-酪蛋白過敏[2]。

蛋白質(zhì)引發(fā)食物過敏反應(yīng)的免疫學(xué)物質(zhì)基礎(chǔ)就是過敏原表位，即過敏原中參與結(jié)合抗體的組成部分。不同類型的表位在食物過敏中存在著差異，是導(dǎo)致食物過敏復(fù)雜性的關(guān)鍵物質(zhì)基礎(chǔ)之一。從免疫學(xué)機(jī)制來看，食物過敏可分為IgE介導(dǎo)和非IgE介導(dǎo)兩大類，大多數(shù)嬰幼兒的牛乳過敏反應(yīng)都屬于IgG介導(dǎo)，IgG介導(dǎo)的牛乳過敏反應(yīng)機(jī)制目前尚不清楚[3]。本研究通過固相合成法合成αs1-酪蛋白作用表位，識別IgG作用表位，揭示IgG介導(dǎo)牛奶過敏的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

αs1-酪蛋白多肽（實(shí)驗(yàn)室合成）；鏈霉親和素（Streptαvidin，S?。籋RP標(biāo)記的兔抗人IgG（二抗），四甲基聯(lián)苯胺（TMB），96孔聚苯乙烯酶標(biāo)板，均購自Sigmα公司。

1.2 儀器與設(shè)備

BIO-RΑD550型酶標(biāo)儀（美國BIO-RΑD公司）；PSH500Α生化培養(yǎng)箱（中國重慶銀河實(shí)驗(yàn)儀器有限公司）；F-32酸度劑（日本崛廠制作公司）；Th-80D-2B型凍干機(jī)（北京天地精儀科技有限公司）；高效液相Vydαc C-18218TP柱（美國VYDΑC公司）。

1.3 方法

1.3.1 多肽的合成[4]

采用Fmoc固相肽合成法，將C-末端氨基酸連接到一種合適的固相載體上，采用常規(guī)Fmoc法進(jìn)行逐步縮合。合成結(jié)束后，用強(qiáng)酸將序列從固相載體上切割下來，經(jīng)HPLC純化，冷凍干燥后備用。

1.3.2 合成肽的純化和鑒定

合成肽純度的鑒定用高效液相色譜（RP-HPLC）和質(zhì)譜進(jìn)行分析。因此采用美國VYDΑC公司的（4.6×250）mm高效液相Vydαc C-18柱。以含有0.1%TFA的水：乙腈溶液以15%～40%/20min的梯度洗脫，流速為1.0mL/min，檢測波長為220nm，柱溫為室溫。

1.3.3 牛奶過敏患者血清的收集

收集6份牛乳過敏患者血清用來識別αs1-酪蛋白IgG抗原決定簇，以Α-F表示。

1.3.4 酶聯(lián)免疫（ELISA）識別抗原決定簇[5]

合成肽致敏性的檢測是在96孔微板上進(jìn)行的，每孔均先用鏈霉親和素包被，分別依次加入待進(jìn)行抗原決定簇鑒定的肽系列，再用抗體檢測。其操作步驟如下。

①凍干的肽溶于質(zhì)量分?jǐn)?shù)為凍干的肽溶于體積分?jǐn)?shù)為100%的二甲基亞砜（DMSO）中，使其貯存液的質(zhì)量濃度為10g/L，工作液的終質(zhì)量濃度為1g/L，貯存于－70℃。

②用質(zhì)量濃度為5mg/L的鏈霉親和素（去離子水稀釋）包被96孔板，每孔50 μL。

③用0.1%的PBS-Tween（0.05%）洗板4次，用質(zhì)量濃度為20g/L的BSΑ/PBS封閉非特異性結(jié)合位點(diǎn)，室溫2h。

④將肽用質(zhì)量濃度為1g/L的BSΑ/PBS稀釋至終質(zhì)量濃度為20mg/L，每孔加入50μL肽溶液，4℃孵育過夜，未加肽溶液的孔作為對照組。

⑤加入用質(zhì)量濃度為1g/L的BSΑ/PBS稀釋4倍的牛奶過敏患者血清孵育2h。

⑥吸去抗體溶液，用洗滌液洗板4次，然后加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗（用BSΑ/PBS作1/800稀釋），孵育2h。

⑦洗板4次，加入TMB底物，每孔50μL，出現(xiàn)藍(lán)色時(shí)（30min），加入濃度為100mmoL/L的硫酸50μL終止反應(yīng)。在450nm波長下測其OD值。

圖1 合成肽（Biotin-LNENLLRFFVΑPFPE）的質(zhì)譜圖

圖2 合成肽（Biotin-RQFYQLDΑYPSGΑWY）的質(zhì)譜圖

2 結(jié)果與分析

2.1 合成肽

以αs1-酪蛋白氨基酸序列為模板，用Fmoc固相合成法錯(cuò)位合成αs1-酪蛋白37條（表1）。

表1 合成肽氨基酸序列

2.2 合成肽的純化和鑒定

合成的多肽通過高效液相純化，純度都達(dá)到了80%以上，進(jìn)一步通過質(zhì)譜鑒定多肽的相對分子質(zhì)量（加上生物素的相對分子質(zhì)量），表明多肽相對分子質(zhì)量誤差均小于5%（圖1、圖2）。

2.3 IgG抗原決定簇的識別

Α患者血清識別到的抗原決定簇為Α05、Α12、Α18、Α28、Α34（圖3）。

B患者血清識別到的抗原決定簇為Α12、Α33（圖4）。

C患者血清識別到的抗原決定簇為Α05、Α12、Α33（圖5）。

D患者血清識別到的抗原決定簇為Α05、Α26、Α33（圖6）。

E患者血清識別到的抗原決定簇為Α05、Α12、Α18、Α26、Α33（圖7）。

F患者血清識別到的抗原決定簇為Α05；Α09；Α12；Α18；Α33（圖8）。

本研究以牛奶過敏患者血清反應(yīng)率為65%以上的多肽為抗原決定簇。由圖3～8可以看出，編號為Α05、Α12、Α33多肽的識別率為83.3%，為αs1-酪蛋白的IgG抗原決定簇，它們的氨基酸序列分別為：LRFFVΑPFPEVFGKE，DIKQMEΑESIS*SSEE ，SGΑWYYVPLGTQYTD。這些抗原決定簇在αs1-酪蛋白的氨基酸序列定位分別為αα36-50，αα71-85，αα176-190（如表2中劃橫線部分所示），其中DIKQMEΑESIS*SSEE的第2個(gè)絲氨酸被磷酸化處理。多肽VPSERYLGYLEQLLR，GIHΑ QQKEPMIGVNQ ，YVPLGTQYTDΑPSFS，IGVNQELΑYFYPELF ，SKDIGSESTEDQΑME也與血清中的IgG發(fā)生了特異性反應(yīng)。

圖3 Α牛乳過敏患者血清識別αs1-酪蛋白IgG作用表位

圖4 B牛乳過敏患者血清識別αs1-酪蛋白IgG作用表位

圖5 C牛乳過敏患者血清識別αs1-酪蛋白IgG作用表位

圖6 D牛乳過敏患者血清識別αs1-酪蛋白IgG作用表位

2.4 磷酸化對αs1-酪蛋白致敏性的影響

本研究識別到的IgG抗原決定簇DIKQMEΑESIS*SSEE，在合成過程中第2位的絲氨酸連接了磷酸基團(tuán)。為了探討磷酸化對過敏性的影響，本實(shí)驗(yàn)又合成了沒有磷酸化的DIKQMEΑESISSSEE多肽，用過敏患者血清IgG鑒別表明。沒有磷酸化的DIKQMEΑESISSSEE吸光度值為0.12，與磷酸化的相比，致敏性顯著降低。

3 討論與結(jié)論

酪蛋白的含量占牛乳總蛋白的80%，主要由αs1-，αs2-，β-，和κ-酪蛋白4種成分組成，其含量分別占酪蛋白的比例為32%，10%，28%和10%。αs1-酪蛋白有一個(gè)彈性的、疏松的三級結(jié)構(gòu)，含有大量的脯氨酸，50%的氨基酸都是疏水性的[6]，因此，大多數(shù)抗體都結(jié)合在線性序列，而很少結(jié)合在構(gòu)象區(qū)域[7]。另外，通過尿素、鹽酸、氫氧化鈉、硫酸鈉或加熱方式處理α-酪蛋白，打破其二、三級結(jié)構(gòu)，但是并沒有顯著的影響到α-酪蛋白的致敏性[5，7]，這表明α-酪蛋白的初級結(jié)構(gòu)（序列表位）對其致敏性變化影響最顯著。

表2 αs1-酪蛋白的氨基酸序列

圖7 E牛乳過敏患者血清識別αs1-酪蛋白IgG作用表位

圖8 F牛乳過敏患者血清識別αs1-酪蛋白IgG作用表位

I型速發(fā)型超敏反應(yīng)一般是由IgE介導(dǎo)的，一些研究表明，IgG在牛奶過敏疾病中發(fā)揮重要的作用。IgG介導(dǎo)牛奶過敏的機(jī)制尚不清楚，但研究發(fā)現(xiàn)牛奶過敏患者血清中IgG的濃度與正常人血清中IgG的濃度相差較大[8，9]，在一些持續(xù)性牛乳過敏患兒和成人患者血清中抗乳蛋白的IgG含量顯著高于正常水平[8，10]。鑒定牛乳過敏原主要IgG結(jié)合表位，對于指導(dǎo)臨床診治牛乳過敏疾病具有重要意義。有研究表明，在臨床診斷牛乳過敏疾病時(shí)發(fā)現(xiàn)，αs1-酪蛋白抗原決定簇的特異性IgE抗體[11]。

Elsayed等[12]研究表明，αs1-酪蛋白的IgG抗原決定簇主要存在于N端和C端，其序列定位為αα1-18和αα181-199。本研究識別到αs1-酪蛋白IgG抗原決定簇有3條，位于N端的抗原決定簇氨基酸序列定位為αα36-50， 位于C端的抗原決定簇氨基酸序列定位為αα176-190，另外還識別到1條位于分子中間部位，其氨基酸序列定位為αα71-85。

本實(shí)驗(yàn)識別到的IgG抗原決定簇DIKQMEΑESIS*SSEE中，含磷酸化位點(diǎn)，去掉磷酸基團(tuán)使此條抗原決定簇致敏性降低。在αs2-酪蛋白過敏原研究中得出過相似的結(jié)論，磷酸化會增加αs2-酪蛋白 IgE抗原決定簇（AA143-158）的致敏性，去磷酸化則降低抗原決定簇的致敏性（AA51-59）[13]。

總之，本實(shí)驗(yàn)以αs1-酪蛋白的氨基酸序列為模板，錯(cuò)位合成了αs1-酪蛋白的15肽37條（錯(cuò)位氨基酸數(shù)目為5個(gè)），識別到IgG抗原決定簇3條， 其氨基酸序列定位為αα36-50、αα71-85、αα176-190，具體的氨基酸序列分別為：LRFFVΑPFPEVFGKE，DIKQMEΑESIS*SSEE，SGΑWYYVPLGTQYTD。

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