腎透明細(xì)胞癌NOTCH1與JAG1的表達(dá)及意義

吳科榮 張立 許樂(lè) 侯君* 程躍 李和明 謝國(guó)海 嚴(yán)澤軍 蔣照輝

(1.浙江省寧波市第一醫(yī)院泌尿外科,浙江寧波 315010;2.復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院泌尿外科,*病理科,上海 200032)

腎透明細(xì)胞癌是泌尿系統(tǒng)最重要的惡性腫瘤之一,已經(jīng)證實(shí)其發(fā)生發(fā)展與Von Hippel-Lindau(VHL)抑癌基因失活有關(guān)。以此理論為基礎(chǔ)針對(duì)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)受體的分子靶向治療目前已經(jīng)成為轉(zhuǎn)移性腎癌的一線治療,但其仍然存在著有效率低、不良反應(yīng)明顯等缺點(diǎn)[1-3]。隨著對(duì)腎癌分子基因的進(jìn)一步了解,有更多的信號(hào)通路進(jìn)入人們的視線,通過(guò)對(duì)這些通路的研究,不僅可以進(jìn)一步了解腎癌的發(fā)病機(jī)制,而且可能提供其他的治療靶點(diǎn)。Notch通路是進(jìn)化上十分保守的通路,其在細(xì)胞一系列的生理活動(dòng)(包括細(xì)胞分化、增殖、凋亡、粘附、遷移及血管形成等)中都起到了十分重要的作用,而異常的Notch信號(hào)途徑與許多腫瘤的發(fā)生有關(guān)[4-6]。Notch通路與腎癌的關(guān)系尚不十分明確。本研究應(yīng)用免疫組織化學(xué)染色法檢測(cè)跨膜受體蛋白(NOTCH1)和Jagged1基因(JAG1)在腎癌組織及正常腎組織中的表達(dá),并探討其表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系以及NOTCH1與JAG1作為腎癌生物學(xué)指標(biāo)的價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2003—2008年在復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院行腎癌手術(shù),術(shù)后病理證實(shí)為腎透明細(xì)胞癌的患者129例。其中男性84例,女性45例;年齡27～83歲,平均55.5歲。手術(shù)方式:腎根治術(shù)122例(94.6%),腎部分切除術(shù)7例(5.4%)。腫瘤按TNM(2002 AJCC)分期:Ⅰ期81例,Ⅱ期17例,Ⅲ期24例,Ⅳ期7例。按Fuhrman分級(jí):1級(jí)53例,2級(jí)54例,3級(jí)18例,4級(jí)4例。腫瘤大小1.5～15 cm,平均 5.3 cm。129例中有 37例(28.7%)腫瘤復(fù)發(fā),92例(71.3%)未發(fā)現(xiàn)腫瘤復(fù)發(fā)。取正常腎組織33例作為對(duì)照。所有組織標(biāo)本采用10%甲醛固定,石蠟包埋,5μm連續(xù)切片。

1.2 主要試劑 一抗:兔抗人NOTCH 1多克隆抗體(ab27526)(購(gòu)自 Abcam,UK);羊抗人JAG1多克隆抗體 (sc-6011)(購(gòu)自Santa Cruz,USA)。二抗:羊抗兔抗體(購(gòu)自上海長(zhǎng)島);兔抗羊抗體(購(gòu)自北京中衫金橋)。

1.3 免疫組化染色 采用EV二步法染色,石蠟切片60℃烘烤,常規(guī)二甲苯脫蠟,梯度乙醇脫水;3%新鮮雙氧水避光孵育30 min滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶,蒸餾水洗滌;熱抗原修復(fù)(抗原修復(fù)液為p H 6.0枸櫞酸鹽緩沖液);滴加一抗,室溫下孵育1 h,pH 7.4的PBS洗滌3次,滴加辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗,室溫孵育1 h后,PBS洗滌3次,DAB顯色,蘇木素復(fù)染,干燥后中性樹(shù)膠封片。用已知乳腺導(dǎo)管癌陽(yáng)性切片做陽(yáng)性對(duì)照,以PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。

1.4 染色結(jié)果判定 所有的染色片均由3位觀察者獨(dú)立評(píng)價(jià),這3位觀察者對(duì)病例的信息均無(wú)任何了解。染色強(qiáng)度和染色程度的評(píng)價(jià)依據(jù)為既往的文獻(xiàn)[7]報(bào)道:先在低倍鏡下隨機(jī)選擇3個(gè)視野(×40),計(jì)數(shù)100個(gè)腫瘤細(xì)胞陽(yáng)性百分比,定義無(wú)細(xì)胞染色為陰性,1%～20%細(xì)胞染色為1分,21%～60%細(xì)胞染色為2分,61%～100%細(xì)胞染色為3分。然后通過(guò)觀察高倍鏡(×200)下腫瘤細(xì)胞染色強(qiáng)度,定義不著色為0分,淺棕黃色為1分,棕黃色為2分,深褐色為3分。免疫染色評(píng)分(immunoreactive score)為上述2項(xiàng)指標(biāo)之和,定義0～3分為蛋白低表達(dá),4～6分為蛋白高表達(dá)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 所有數(shù)據(jù)均選用SPSS 11.5軟件行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。相關(guān)性檢驗(yàn)采用卡方檢驗(yàn)和Spearman相關(guān)分析,檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 腎癌及正常腎組織中NOTCH 1、JAG1的表達(dá) NOTCH 1、JAG1在腎癌組織中免疫組化染色主要表現(xiàn)為腫瘤細(xì)胞胞膜染色和(或)胞漿染色,小部分腫瘤細(xì)胞核亦染色(圖1、2)。NOTCH 1、JAG1在正常腎組織中的陽(yáng)性表達(dá)率分別為36.4%(12/33)、42.4%(14/33),在腎癌中的陽(yáng)性表達(dá)率分別為 95.3%(123/129)、93.0%(120/129),差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.001)。

2.2 NOTCH 1與JAG1的表達(dá)相關(guān)性 用免疫染色評(píng)分判斷2個(gè)蛋白的表達(dá)。Spearman相關(guān)分析顯示:NOTCH 1表達(dá)和JAG1表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.384,P＜0.001)。

2.3 NOTCH 1、JAG1表達(dá)與腎癌臨床病理的相關(guān)性 隨著腎癌病理分級(jí)和臨床分期的增高,NOTCH1和JAG1的表達(dá)水平均增高(P＜0.05)。NOTCH1和JAG1的表達(dá)水平還與腫瘤大小有關(guān),在直徑≥5 cm腫瘤中的表達(dá)高于在直徑＜5 cm腫瘤中的表達(dá)(P＜0.05)。復(fù)發(fā)組 NOTCH 1和JAG1蛋白的表達(dá)水平均高于未復(fù)發(fā)組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。兩者的表達(dá)水平在不同年齡和不同性別的病例中無(wú)顯著差異(表1)。

表1 NOTCH1、JAG1的表達(dá)與臨床病理參數(shù)間的關(guān)系(例)

3 討 論

Notch廣泛表達(dá)于從無(wú)脊椎動(dòng)物到哺乳動(dòng)物等多個(gè)物種,是一個(gè)在進(jìn)化上十分保守的跨膜受體蛋白家族。Notch最早在T急性淋巴細(xì)胞白血病(TALL)研究中受到關(guān)注。在 T-ALL患者中存在 t(7;9)(q34;q34.3)染色體異位;盡管另外一部分病例不存在這種染色體異位現(xiàn)象,但Notch信號(hào)過(guò)度表達(dá)卻很常見(jiàn)[8]。

已經(jīng)發(fā)現(xiàn)Notch通路在乳腺癌的發(fā)生發(fā)展中起著“促進(jìn)”的作用:Notch通路的組成蛋白,尤其是NOTCH1與JAG1高表達(dá),并且這種高表達(dá)往往提示乳腺癌患者的預(yù)后不良[9]。有報(bào)道JAG1在轉(zhuǎn)移性前列腺癌中的表達(dá)明顯高于在局限性前列腺癌中的表達(dá),并且其表達(dá)水平高低與腫瘤復(fù)發(fā)有關(guān):JAG1高表達(dá)的前列腺癌病例的腫瘤復(fù)發(fā)概率比JAG1低表達(dá)的前列腺癌病例高。

目前Notch與腎癌的關(guān)系尚不十分明確。Sun等[10]的研究結(jié)果顯示Notch在腎透明細(xì)胞癌中低表達(dá)。然而有學(xué)者[11-12]發(fā)現(xiàn)腎透明細(xì)胞癌中NOTCH3、JAG1表達(dá)增加。Nilay等[13]研究結(jié)果顯示Notch在透明細(xì)胞癌中的表達(dá)是在正常腎組織表達(dá)的9倍。Sj?lund等[14]則在腎透明細(xì)胞癌細(xì)胞株中測(cè)得Notch通路各組成蛋白存在并且高表達(dá),并且這種表達(dá)相對(duì)獨(dú)立于經(jīng)典通路中VH L、HIF-1a、HIF-2a的表達(dá);Notch通路各組成蛋白在腎透明細(xì)胞癌組織中的表達(dá)高于在正常腎組織中的表達(dá),其中又以NOTCH 1和JAG1最為顯著。

本研究發(fā)現(xiàn)腎透明細(xì)胞癌組織NOTCH1與JAG1陽(yáng)性表達(dá)率高于正常腎組織。而隨著腎癌的病理分級(jí)、臨床分期的增高和腫瘤的增大,NOTCH1和JAG1的表達(dá)水平均增高。本研究結(jié)果提示Notch通路與腎透明細(xì)胞癌的密切聯(lián)系:Notch高表達(dá)可能與腎透明細(xì)胞癌發(fā)生發(fā)展有關(guān)。復(fù)發(fā)組NOTCH 1和JAG1蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率均高于未復(fù)發(fā)組,提示兩者對(duì)臨床預(yù)后判斷可能具有一定價(jià)值。

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