RQ-PCR技術(shù)檢測白血病融合基因及其臨床應(yīng)用

江 梅綜述，萬臘根審校

(南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗科，江西 南昌 330006)

實時熒光定量PCR技術(shù) (real time quantitative PCR，RQ-PCR)是由美國ABI公司于1995年研發(fā)用于核酸定量檢測技術(shù)，目前該技術(shù)在科研和臨床上已得到了廣泛的應(yīng)用，也為白血病的分子生物學(xué)研究提供了新的手段，已有很多臨床血液病學(xué)家和檢驗學(xué)家應(yīng)用該技術(shù)在白血病融合基因檢測及其臨床應(yīng)用進(jìn)行了大量的研究報道，本文擬就國內(nèi)外的相關(guān)研究報道對檢測白血病融合基因的RQ-PCR技術(shù)作一綜述。

1 白血病融合基因

多數(shù)白血病患者具有特異性染色體異常：如急性早幼粒細(xì)胞白血病 (APL)、慢性粒細(xì)胞白血病(CML)等，由于染色體易位、倒位等變異，使得基因結(jié)構(gòu)重排而產(chǎn)生融合基因，而成為白血病特異性的分子標(biāo)志，因此對融合基因的檢測可用于白血病的分子生物學(xué)分型診斷、預(yù)后觀察及微殘留病灶(MRD)的診斷，目前常見于臨床的白血病融合基因有以下幾種[1-2]。

1.1 bcr-abl融合基因：是由 t(9；22)(q34；q11)，使9q34上的原癌基因abl與22q11上的bcr基因合并形成bcr-abl融合基因，并轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生8.5kb的融合mRNA。染色體易位時abl基因的斷裂點位于第二外顯子 (a2)(實際是從第1內(nèi)含子到第2內(nèi)含子間＞100kb的區(qū)域)，斷裂點相對比較固定，bcr基因的斷裂點有三個，在CML集中于中部第12～15外顯子和相應(yīng)內(nèi)含子長約5.8kb的M-bcr區(qū)，且主要在第13(b2)和第14(b3)外顯子斷裂形成b2a2和b3a2亞型；第三個斷裂點位于第1內(nèi)含子中2個較小的bcr-1或bcr-2區(qū)形成m-bcr/abl融合基因 (e1a2亞型)，b2a2，b3a2和 e1a2分別編碼 P210、P210和 P190蛋白，文獻(xiàn)[3]報道 100%CML病人檢出 bcr/abl，因此bcr-abl融合基因檢測可用于CML的分子診斷。

1.2 PML-RARa融合基因：是由于 t(15，17)(q22；q22)染色體易位，使17號染色體上的RARa基因與位于15號染色體上的PML基因融合后形成的PML-RARa融合基因，PARa僅一個斷裂點位于2號內(nèi)含子，PML基因有3個斷裂點，分別位于6號外顯子、6號內(nèi)含子和3號內(nèi)含子，形成Long(55%)、Varint(5%)和 Short(40%)三個亞型。PML-RARa融合基因是APL的特異性分子標(biāo)志，見于98%的APL病人[3]。因此PML-RARa基因檢測可用于APL分子診斷。

1.3 AML1-ETO 融合基因：t(8；21)(q22；q22)易位，使位于22q22的AML1基因在5號內(nèi)含子處斷裂與位于8q22的ETO基因在2號外顯子處斷裂后融合形成AML1-ETO融合基因，AML1-ETO融合基因主要發(fā)生于M2的白血病中，文獻(xiàn)[3]報道陽性率達(dá)90%，可作為M2b診斷的重要分子標(biāo)志，也可用于其它AML如M1、M4、M5的分子分型診斷，且其陽性時預(yù)后良好，完全緩解率高達(dá)98%，5年存活率達(dá)67%。因此AML1-ETO融合基因的檢測可作為M2b和部分其它AML診斷、預(yù)后觀察及MRD診斷的分子標(biāo)志。

1.4 CBFβ—MYH11融合基因：是由于inv(16)(p13；q22)，使位于16q22的CBFβ基因在5號外顯子處斷裂，與位于16p13的MYH11基因在12號外顯子(A)或8號外顯子(D)或7號外顯子(E)斷裂點斷裂而形成約10個亞型的CBFβ-MYH11融合基因，其中A亞型占88%、D亞型占5%、E亞型占5%，文獻(xiàn)[3]報道M4EO病人CBFβ-MYH11融合基因陽性率達(dá)85.7%，且CBFβ-MYH11陽性者預(yù)后好。因此CBFβ-MYH11融合基因可作為M4EO診斷、療效觀察及MRD診斷的分子標(biāo)志。

1.5 TEL/AML1融合基因：t(12；21)(p13；q22)的易位使位于12p13的TEL基因在5號內(nèi)含子處斷裂與位于21q22的AML基因在1號內(nèi)含子或2號外顯子處斷裂而形成TEL/AML1融合基因，是兒童前B-ALL最常見的染色體異常之一，其陽性率可達(dá)20～25%[4]，其陽性表達(dá)預(yù)后較好，因此TEL/AML1融合基因可作為ALL診斷、療效觀察及MRD診斷的分子標(biāo)志。

1.6 E2A/PBX1 融合基因：t(1；19)(q13；p22)易位使位于1q13的PBX1基因在1～3號外顯子之間斷裂與位于19 p22的E2A基因在13-14號外顯子之間斷裂而融合形成E2A/PBX1融合基因，見于5%左右的兒童ALL，在B-ALL中占 20～25%[5]，但其陽性與預(yù)后關(guān)系不明顯，但是可作為ALL及MRD診斷的分子標(biāo)志。

1.7 MLL重排形成的基因：MLL基因位于11q23，白血病時MLL基因會發(fā)生重排，形成融合基因如t(11；4)(q23；q21)的易位，使位于 11q23 的 MLL 基因于8～12號外顯子之間斷裂與位于4q21的AF4基因在3～7號外顯子之間斷裂后融合，形成MLL/AF4融合基因。 還有 t(9；11)(p21-22；q23)形成 MLL-AF9融合基因；t(11；19)(q22；p13)形成 MLL-ENL 融合基因。95%MLL-AF4融合基因多見于ALL，MLL-AF9見于86%的AML中的M5型，成熟MLL-ENL幾乎全為AML[6]。

1.8 其它融合基因：隨著白血病分子生物學(xué)研究的深入，將有新的異常核型或新的融合基因發(fā)現(xiàn)，如DEK-CAN、AML1-MIG8、PLZE-RARa融合基因等，它們均將成為白血病分子診斷、預(yù)后判斷及MRD診斷的分子標(biāo)志。

2 RQ-PCR技術(shù)

RQ-PCR技術(shù)是在常規(guī)PCR基礎(chǔ)上加入熒光染料或熒光標(biāo)記探針然后通過熒光定量PCR儀檢測PCR過程中熒光強(qiáng)度的變化，達(dá)到對樣品靶序列進(jìn)行定量檢測的目的，目前用于白血病融合基因定量檢測的RQ-PCR技術(shù)有以下幾種。

2.1 DNA結(jié)合染料技術(shù)：是在PCR反應(yīng)體系中加入SYBRGreenI熒光染料，因為該熒光染料能與雙鏈DNA結(jié)合，產(chǎn)生強(qiáng)烈熒光，在PCR過程中，隨著擴(kuò)增產(chǎn)物DNA分子的增多，結(jié)合的SYBRGreenI也增多，熒光信號與擴(kuò)增產(chǎn)物DNA的含量成正比，因此用熒光定量PCR儀檢測PCR過程中延伸期的SYBRGreenI熒光強(qiáng)度(在每個循環(huán)的延伸期完成后檢測)，可對樣品的靶序列(或基因)進(jìn)行定量檢測。但是由于SYBRGreenI能與任何DNA結(jié)合，即也能與PCR反應(yīng)體系中的非特異的dsDNA，如引物二聚體結(jié)合，使PCR反應(yīng)體系中的熒光本底偏高，但可通過用有熔解曲線分析軟件的PCR加以解決[7]。

2.2 Taqman水解探針技術(shù)：它是在PCR反應(yīng)體系中設(shè)計一條熒光素標(biāo)記的探針，在探針的5’端和3’端分別標(biāo)記熒光報告基團(tuán)R和熒光淬滅基團(tuán)Q，探針完整時Q基團(tuán)會抑制R基團(tuán)不能發(fā)射熒光，而TaqmanDNA聚合酶即有沿著模板移動合成DNA新鏈又具有5’-3’外切核酸酶活性，能逐個水解探針上的脫氧核甘酸，使得R基團(tuán)與Q基團(tuán)分離，R基團(tuán)便可發(fā)射熒光，因此在PCR過程中，隨著DNA擴(kuò)增，R基團(tuán)產(chǎn)生的熒光信號逐漸增強(qiáng)，因而PCR儀可通過檢測熒光強(qiáng)度 (在每個循環(huán)的延伸過程中檢測)，便可推算出初始靶序列的拷貝數(shù)[8]。這是目前RQ-PCR應(yīng)用最多的檢測技術(shù)。

2.3 雜交探針技術(shù)：它是利用熒光共振能量轉(zhuǎn)移的原理，在PCR反應(yīng)體系中設(shè)計兩條探針，探針A上標(biāo)記熒光供體基團(tuán)，探針B上標(biāo)記熒光受體基團(tuán)，兩探針與靶序列雜交時，兩探針是以頭尾方式雜交于靶序列上，其間距在1～5個bp，這時便產(chǎn)生熒光，在PCR反應(yīng)過程中，隨著靶序列的擴(kuò)增，與靶序列雜交的探針增多，熒光強(qiáng)度也增強(qiáng)，這樣熒光強(qiáng)度與PCR反應(yīng)中的DNA量成正比，因而PCR儀便可通過檢測熒光強(qiáng)度計算出初始靶序列的拷貝數(shù)[9]。

3 RQ-PCR檢測白血病融合基因檢測方法及分析性能

3.1 RQ-PCR檢測白血病融合基因的方法：

參閱國內(nèi)外文獻(xiàn)，應(yīng)用RQ-PCR檢測白血病融合基因，其實都是檢測其RNA的表達(dá)，大多采用的是Taqman水解探針、雜交探針及DNA染料的結(jié)合的RQ-PCR技術(shù)，其中使用最多的為水解探針技術(shù)，各檢測技術(shù)雖然在原理上有差異，但其使用的儀器(實時熒光定量PCR儀)和建立的檢測方法大同小異，具體方法或操作流程如下。

3.1.1 制備目的基因和管家基因的RNA標(biāo)準(zhǔn)品：目的基因的RNA標(biāo)準(zhǔn)品文獻(xiàn)報道[10]采用提取、回收純化目的基因后再行分子克隆和體外轉(zhuǎn)錄，得到轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物后再進(jìn)行抽提、精制，測吸光度(A)值，根據(jù)阿佛加德常數(shù)(6.02×1023copies/mol)換算成目的基因分子拷貝數(shù)。制定標(biāo)準(zhǔn)曲線時對目的基因進(jìn)行梯度稀釋得到目的基因不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品。管家基因的RNA標(biāo)準(zhǔn)品大多是采用提取、回收純化再進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄得到管家基因的標(biāo)準(zhǔn)品。

3.1.2 樣品RNA的提取：由于RQ-PCR測定的是融合基因RNA的表達(dá)量，因此要對樣品(骨髓液或外周血)中的有核細(xì)胞進(jìn)行RNA的提取，RNA的提取采用的是常規(guī)RNA提取和純化精制的方法。

3.1.3 RNA的逆轉(zhuǎn)錄：由于RQ-PCR儀是對RNA進(jìn)行定量測定，所以對融合基因RNA定量時，首先要對RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄成cDNA后再進(jìn)行定量。

3.1.4 PCR擴(kuò)增定量：對逆轉(zhuǎn)錄后的融合基因和管家基因cDNA；陽性對照，陰性對照及融合基因和管家基因標(biāo)準(zhǔn)品在熒光定量PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增，由計算機(jī)自動將樣品與標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行比對換算出目的融合基因和管家基因的拷貝數(shù)。

3.1.5 結(jié)果報告：由于RQ-PCR是檢測目的基因RNA的表達(dá)量，因此不同的樣品即使反應(yīng)起始時使用相同的RNA量，由于細(xì)胞來源不同，RNA的總表達(dá)量并非一致，進(jìn)行表達(dá)量比較的不是RNA量相同，而是相同細(xì)胞數(shù)的RNA最重要，但要將樣品統(tǒng)一到相同細(xì)胞數(shù)進(jìn)行提取非常困難而且不能保證提取效率，所以需采用內(nèi)對照，使用管家基因進(jìn)行校正[10]。為此目前融合基因RNA表達(dá)量的結(jié)果報告有多種方式：①報告目的基因的對數(shù)值(lg)：首先從管家基因abl的定量結(jié)果求出RNA的誤差，然后將目的基因PML-RARa的定量結(jié)果進(jìn)行校正，由校正后的定量結(jié)果，再計算出樣品之間的對數(shù)值，最后得出目的基因PML-RARa的對數(shù)值，再進(jìn)行對數(shù)轉(zhuǎn)換[10]。②報告目的基因的拷貝數(shù)：考慮到各樣本總RNA濃度的差異，最終計算結(jié)果按下列公式換算：A(拷貝數(shù)/μg 總 RNA)=B(拷貝數(shù)/μl cDNA)÷OD260×1.05，A值即為統(tǒng)計的最終需要的數(shù)值[11]。③報告目的基因相對于管家基因的比值：考慮到每個樣品總RNA濃度可能存在差異，以管家基因表達(dá)作為內(nèi)參照，結(jié)果以目的基因的拷貝數(shù)與管家基因的拷貝數(shù)的比值乘以104來表示[12]，選用各種細(xì)胞中表達(dá)量較恒定的β-actin基因為參照基因且結(jié)果以bcl/abl拷貝數(shù)/β-actin拷貝數(shù)表示，使之更加標(biāo)準(zhǔn)化[13]。④直接報告RNA基因的拷貝數(shù)/L：如邢秀華作者的“白血病bcr/abl mRNA的熒光定量RT-PCR檢測”的研究，就是以bcr/abl基因表達(dá)的拷貝數(shù)(基因拷貝/L)報告結(jié)果的[14]。

3.2 RQ-PCR檢測白血病融合基因的分析性能

3.2.1 目的基因標(biāo)準(zhǔn)品反應(yīng)性能：RQ-PCR要對目的基因和管家基因進(jìn)行定量必須檢測其標(biāo)準(zhǔn)品，制定標(biāo)準(zhǔn)曲線，只有具有良好的線性關(guān)系，才能推算出正確的檢驗結(jié)果，目的基因和管家基因的標(biāo)準(zhǔn)品都是提取純化，分子克隆和體外轉(zhuǎn)錄得到的精制RNA 標(biāo)準(zhǔn)品。大多文獻(xiàn)報道[10，15，16]RQ-PCR 檢測目的基因和管家基因的RNA標(biāo)準(zhǔn)品的拷貝數(shù)與Ct值相關(guān)性好，回歸系數(shù)多在0.998以上，且具有良好的線性關(guān)系，因此為病人樣品目的基因的檢測提供了準(zhǔn)確度保證。

3.2.2 靈敏度：RQ-PCR作融合基因檢驗時其靈敏度可達(dá)到 1×101拷貝[17-18]。

3.2.3 線性范圍：文獻(xiàn)報道[18]，在 102～106拷貝/ul的范圍內(nèi)重復(fù)性好，CV為1.91%，說明線性范圍寬，符合臨床檢測要求。

3.2.4 特異性和精密度，姜艷梅作者[16]在應(yīng)用RQ-PCR檢測急性髓系白血病AML1/ETO融合基因時，對RQ-PCR進(jìn)行了方法學(xué)評價，結(jié)果顯示6例AML1/ETO融合基因陰性的標(biāo)本均為陰性，說明特異性好。同一樣本同一批內(nèi)檢測10次，其批內(nèi)變異為6%；同一樣本在每次實驗時進(jìn)行檢測，其批間變異為10%，具有良好的精密度和特異度。

4 RQ-PCR檢測白血病融合基因的臨床意義

融合基因的檢測方法很多，有染色體顯帶核型分析、熒光原位雜交(FISH)及PCR技術(shù)，Uckun[19]等分別用常規(guī)細(xì)胞核型分析、常規(guī)PCR以及巢式RTPCR的方法檢測ALL患兒的t(4；11)易位時發(fā)現(xiàn)，PCR比細(xì)胞核型分析敏感，而巢式RT-PCR敏感性又是常規(guī)PCR的100倍，而RQ-PCR的敏感度具有巢式RT-PCR的敏感性，又是定量分析。因此更具有臨床應(yīng)用價值：

4.1 用于白血病分子診斷和療效觀察：很多融合基因如PAML/RAPa是某些白血病的特異性的標(biāo)志，因而可作為白血病的分子診斷標(biāo)志，同時文獻(xiàn)[15]報道APL初診組、CR組和復(fù)發(fā)組的目的基因(PML/RARa)的水平差異較大，初診組的對數(shù)值較高，CR組較低，復(fù)發(fā)組又增高。說明RQ-PCR檢測融合基因可作為白血病診斷、化療完全緩解(CR)及復(fù)發(fā)的觀察指標(biāo)。

4.2 從分子水平確定完全緩解的新標(biāo)準(zhǔn)：目前以細(xì)胞形態(tài)學(xué)作為白血病臨床緩解的標(biāo)準(zhǔn)已不能適用于臨床，隨著RQ-PCR臨床上的應(yīng)用，可使臨床醫(yī)師進(jìn)一步了解白血病患者緩解后體內(nèi)的白血病細(xì)胞的動力學(xué)特性，獲得一個從分子水平確定的完全緩解的新標(biāo)準(zhǔn)從而能夠?qū)εR床治療反應(yīng)作出正確評價，及時調(diào)整治療方案，減輕患者經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)同時減少不必要的化療造成的痛苦[10]。

4.3 MRD診斷：MRD是導(dǎo)致白血病復(fù)發(fā)的主要原因[20]，常規(guī)細(xì)胞遺傳學(xué)研究檢測MRD的敏感性很有限(＜10-2)，F(xiàn)ISH 的敏感性也不高(＜10-3)，而且如MRD水平很低時又很難與背景區(qū)別，目前就臨床而言，對于染色體重排明確的白血病患者M(jìn)RD重要檢測手段是定性PCR技術(shù)，靈敏度可達(dá)到10-4～10-6[21]，MRD的動態(tài)定量變化則對預(yù)示復(fù)發(fā)是有肯定意義，比定性PCR更有意義[22]。因此RQ-PCR用于動態(tài)監(jiān)測MRD應(yīng)成為可行的常規(guī)檢查。

綜上所述，RQ-PCR作為一項新的檢驗技術(shù)其定量檢測白血病融合基因具有良好的分析性能。雖然存在操作過程復(fù)雜，檢測RNA時干擾和影響因素多，結(jié)果報告不統(tǒng)一以及存在對某一融合基因而言覆蓋仍不夠廣泛等不足。但隨著對RQ-PCR定量檢測各種融合基因及其臨床應(yīng)用研究的深入，同時隨著該技術(shù)的成熟和用于臨床檢驗的標(biāo)準(zhǔn)化，以及越來越多的特異性融合基因被識別，RQ-PCR檢驗技術(shù)必將常規(guī)應(yīng)用于白血病的分子診斷、預(yù)后觀察和MRD診斷。

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