豬鏈球菌 2型毒力相關(guān)因子研究進(jìn)展

朱 僧,孫長江,雷連成,韓文瑜

(吉林大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院,吉林長春,130062)

豬鏈球菌 2型(Streptococcus suis serotype 2,SS2)被認(rèn)為是豬鏈球菌 35個(gè)血清型(1～34型和 1/2型)中分布最廣致病性最強(qiáng)的一個(gè)血清型,可以引起斷奶仔豬的腦膜炎、支氣管肺炎、敗血癥、關(guān)節(jié)炎等,而且 SS2是可以引起人類感染的病原體,特別是那些與豬或者豬肉制品緊密接觸的人群[1]。SS2感染人之后可以引起人的化膿性關(guān)節(jié)炎、腦膜炎、心內(nèi)膜炎和中毒性休克綜合癥等[2]。中國自 1958年首次報(bào)道豬鏈球菌病以來,該病的發(fā)生呈上升趨勢,而且危害日趨嚴(yán)重。在 1998年和 2005年兩次爆發(fā)豬鏈球菌病的地方性流行,引起近百人感染豬鏈球菌,造成 53人死亡[3]。由此可見,SS2不僅給養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失,也給人類的健康帶來嚴(yán)重的威脅,引起了國內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注。

當(dāng)前,SS2的控制和消滅仍然具有很大的困難。為了建立該病快速有效的診斷方法以及可靠的防治措施,科研工作者們對其致病機(jī)理進(jìn)行了深入的研究,發(fā)現(xiàn)了多種與 SS2致病性相關(guān)的毒力因子,例如莢膜多糖、溶菌酶釋放蛋白、胞外因子、溶血素等。隨著研究的逐漸深入,發(fā)現(xiàn)了更多與 SS2毒力相關(guān)的蛋白質(zhì)和基因序列。本研究就 SS2主要的毒力因子進(jìn)行綜述,為 SS2的深入研究提供科學(xué)依據(jù)和參考。

1 多糖類

莢膜多糖(capsular polysaccharide,CPS)是唯一被證實(shí)的毒力因子,CPS由鼠李糖、半乳糖、葡萄糖、N-乙酰葡萄糖胺和唾液酸組成[4]。CPS對 SS2的侵襲力有決定性作用,可以在未免疫動(dòng)物體內(nèi)產(chǎn)生具有抗吞噬活性功能的抗體,保護(hù)細(xì)菌不被體內(nèi)的巨噬細(xì)胞吞噬。Charland等[5]研究發(fā)現(xiàn),缺失CPS可以明顯提高菌株的疏水性和小鼠巨噬細(xì)胞及豬單核細(xì)胞的吞噬作用。Smith等[6]通過插入突變構(gòu)建了 2株莢膜抗原的表型突變菌株。與 SS2野生型菌株相比,無莢膜的菌株對體外的豬肺巨噬細(xì)胞的攝入很敏感。實(shí)驗(yàn)還證明,這 2個(gè)突變菌株在鼠和豬的感染模型上都是無毒力的。但由于無毒力菌株同樣具有莢膜的存在,表明存在著其他的毒力因子導(dǎo)致 2種菌株之間的毒力差異。另外,根據(jù)莢膜多糖的差異性,用協(xié)同凝集實(shí)驗(yàn)等方法,可以將豬鏈球菌分為 35個(gè)血清型:1～34型及 1/2型。

2 蛋白類

2.1 溶菌酶釋放蛋白(MRP)

溶菌酶釋放蛋白(muramidase-released protein,MRP)是一種胞壁蛋白,具有良好的免疫原性。目前已發(fā)現(xiàn) MRP類似物(MRP*和 MRPS)的存在。曾巧英等[7]以 Hep2細(xì)胞為研究模型,結(jié)果發(fā)現(xiàn) MRP可以誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生 2種典型的形態(tài)學(xué)變化:誘導(dǎo)細(xì)胞融合成多核細(xì)胞,然后巨噬細(xì)胞發(fā)生凋亡;誘導(dǎo)單個(gè)細(xì)胞凋亡。投射電鏡和流式細(xì)胞儀分析證明 MRP具有誘導(dǎo)上皮細(xì)胞凋亡的功能(凋亡率達(dá)到18%)。MRP還具有粘附的作用,含有 MRP的菌株可以抵抗巨噬細(xì)胞的吞噬并且粘附到上皮細(xì)胞上,但是如果 56℃加熱 1 h或者使用胰酶、半乳糖處理菌株后可阻斷其粘附。這些結(jié)果表明,MRP對 SS2的毒力起到一定的作用,參與了 SS2的治病過程。

2.2 胞外因子(EF)

胞外因子(extracellular,EF)是一種分泌型蛋白,僅可以從培養(yǎng)上清中檢出。目前認(rèn)為 MRP和 EF是 SS2的兩種重要的毒力因子,Vecht等[8]發(fā)現(xiàn)病豬的分離株中一般含有這兩種蛋白而健康豬的分離株中則大多數(shù)不含有。從歐洲國家病豬中分離得到的 SS2多為 MRP+EF+型,而北美洲則多為 MRPEF-型[9]。另外,這兩種蛋白和毒力之間有著密切的關(guān)系。大多數(shù)豬源強(qiáng)毒菌株既有 MRP又有 EF,而人源強(qiáng)毒株中僅 15%為 MRP+EF+表現(xiàn)型,另有 74%為 MRP+EF-,MRP+EF-的表現(xiàn)型在人源株中較為多見,而豬源菌株中該表現(xiàn)型較少,且對豬僅表現(xiàn)溫和毒力。但是有實(shí)驗(yàn)表明這兩種蛋白對 SS2的致病性并非不可缺少的。由此可見,SS2的治病作用是多因素作用的結(jié)果,MRP和 EF的存在對 SS2的毒力沒有正相關(guān)關(guān)系。

2.3 溶血素

溶血素(suilysin,sly)是由豬鏈球菌產(chǎn)生釋放的具有細(xì)胞作用的毒素物質(zhì),也是一種可以被巰基活化的蛋白毒素。SS2的溶血素是一種溶細(xì)胞性蛋白毒素,而且對人的 O型紅細(xì)胞最敏感。此外 SS2的溶血素還具有細(xì)胞毒性作用,可以導(dǎo)致人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生病變,而且這種病變可以被 SS2溶血素抗體所抑制。體內(nèi)研究表明,強(qiáng)毒菌株產(chǎn)生的溶血素可以增強(qiáng)上皮細(xì)胞的侵入和細(xì)胞溶解的作用[10]。進(jìn)一步的研究表明,溶血素陽性的豬鏈球菌菌株可以引起粘附和細(xì)胞損傷,造成豬菌血癥和腦膜炎[11]。溶血素在SS2侵襲和裂解 Hep-2細(xì)胞過程中發(fā)揮了重要的作用,說明溶血素是 SS2的重要毒力相關(guān)基因[12]。

2.4 纖維蛋白原結(jié)合蛋白(FBPS)

纖維蛋白原結(jié)合蛋白(FBPS)是除了 32型和 34型以外所有類型的豬鏈球菌都存在的一種毒力因子。豬鏈球菌 2型的纖維蛋白原結(jié)合蛋白(FBPS)可以粘附到人的血纖粘蛋白原和纖維蛋白原上,幾乎所有菌株都存在 fbps這個(gè)基因,但是否所有的血清型中 fbps基因都表達(dá)還不清楚.。De Greeff等[13]試驗(yàn)證實(shí) fbps表達(dá)產(chǎn)物對豬具有免疫原性,可以產(chǎn)生特異性抗體,作為交叉保護(hù)性抗原。試驗(yàn)顯示,fbps基因缺失菌株的毒性低于野毒株,但是兩種菌株在扁桃體內(nèi)的定植沒有差別而在關(guān)節(jié)和中樞神經(jīng)系統(tǒng)的定植效率較高。Tan等[14]試驗(yàn)表明,fbps基因在感染 SS2的 24 h內(nèi)表達(dá)上調(diào),說明 FBPS在豬鏈球菌侵入的過程中發(fā)揮一定的作用。

2.5 毒力相關(guān)基因 ORF2

Sm ith等[15]通過體內(nèi)互補(bǔ)法將 SS2強(qiáng)毒株基因文庫引入遺傳背景相似的弱毒株,之后接種無毒仔豬,從神經(jīng)系統(tǒng)中分離病原,發(fā)現(xiàn)一段毒力相關(guān)的基因序列 ORF2。將 ORF2序列導(dǎo)入兩株不同的弱毒株后發(fā)現(xiàn)其毒力都增強(qiáng),因此認(rèn)為 ORF2可能是一種新的毒力因子。有研究表明,ORF2不僅存在于 R群鏈球菌中,A,B,C,D等鏈球菌血清型中均存在,說明 ORF2是一種普遍存在的毒力因子,但是其致病作用還需要進(jìn)一步的研究。

2.6 Trag基因

Trag基因是利用體內(nèi)誘導(dǎo)抗原技術(shù) IVIT通量篩選鑒定的 SS2性的致病相關(guān)因子,是 IV型分泌系統(tǒng)的組成部分[16]。Trag在大多數(shù)強(qiáng)毒力 SS2中均可檢測到存在,而無毒力菌株 T15中則沒有[17]。Trag在體外培養(yǎng)只是一過性表達(dá),而在體內(nèi)感染時(shí) Trag轉(zhuǎn)錄水平持續(xù)上升表明可能與 SS2體內(nèi)感染相關(guān)。另外,Trag在細(xì)菌感染過程中可能參與毒力因子的轉(zhuǎn)移,毒力蛋白的分泌使宿主菌產(chǎn)生相應(yīng)的酶或毒素導(dǎo)致毒力增強(qiáng)。

3 酶類

3.1 谷氨酸脫氫酶

谷氨酸脫氫酶是 Okwumabua等[18]篩選到的 45-kDa豬鏈球菌特異性蛋白。核算序列分析表明,GDH基因包括一個(gè)開放性閱讀框,編碼 448個(gè)氨基酸殘基,在細(xì)胞表面表達(dá)。核酸雜交結(jié)果表明,GDH基因在所有 SS2內(nèi)是保守的。將這段基因克隆表達(dá),提純?nèi)诤系鞍字苽涠嗫?發(fā)現(xiàn)此多抗能與其他分離株中分子量相同的蛋白反映,說明此基因的普遍性和它表達(dá)的保守蛋白具有免疫原性。同時(shí),這個(gè)蛋白又能特異性的與免疫了 SS2型的豬的抗血清反應(yīng),說明它可以作為豬鏈球菌感染的診斷抗原。而且根據(jù) GDH蛋白的非變性電泳圖譜的不同,能夠區(qū)分出高致病株、中等毒力株和無毒株。

3.2 分泌型核酸酶 A

Fontaine等[19]從致病性 SS2中發(fā)現(xiàn)的一種分泌型核酸酶(S.suis secredted nuclease A,SsnA)基因。通過對多種血清型豬鏈球菌進(jìn)行基因檢測和活性檢測,結(jié)果發(fā)現(xiàn) SsnA在多種型別的豬鏈球菌中都存在,但主要在豬鏈球菌 2型中表達(dá)。RT-PCR證明,SsnA在該菌的整個(gè)生長周期中均分泌,丙烯酰胺凝膠電泳和Western blotting進(jìn)一步證明,SsnA屬于胞內(nèi)分泌,分布在細(xì)菌的細(xì)胞膜上,而 Ca2+和 Mg2+為 SsnA的活性必需因子。分析了分離于豬體表(鼻拭子或上頜棉拭子)和豬體內(nèi)(關(guān)節(jié)、腦、其他內(nèi)部器官)的豬鏈球菌,發(fā)現(xiàn) SsnA的表達(dá)水平與菌株的分離位置密切相關(guān),提示這可能是一種新型的毒力因子。

3.3 次黃嘌呤核苷酸脫氫酶

次黃嘌呤核苷酸脫氫酶(inosine 5'-monophoshate dehydrogenase,IMPDH)是均四聚體酶,包含 4個(gè)55Kda的亞基。IMPDH是嘌呤生物合成的關(guān)鍵酶,它催化鳥嘌呤核苷酸從頭合成的限速步驟,依賴 NAD的協(xié)同作用,將次黃嘌呤核苷酸 XMP氧化為黃嘌呤核苷酸 XMP,然后在 GMP合成酶的催化下氨化為GMP,IMPDH受抑直接導(dǎo)致尿普酸水平降低。研究結(jié)果表明,除血清 17,24,32,33和34型外,IMPDH的基因還存在于其他的血清型中;IMPDH的基因能明顯改變 Hep-2細(xì)胞膜的通透性,利于菌體穿過細(xì)胞膜屏蔽進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)增殖,從而致病,所以推測 IMPDH的基因可能是豬鏈球菌2型的一個(gè)新的毒力因子[20]。

3.4 谷氨酰胺合成酶

最近研究表明,包括營養(yǎng)代謝在內(nèi)的多個(gè)系統(tǒng)特別是谷氨酸代謝系統(tǒng)是細(xì)菌重要的毒力因子[21～24]。Si等[25]研究了 SS2中谷氨酰胺合成酶的作用,通過構(gòu)建谷氨酰胺合成酶無效突變菌株分析其互補(bǔ)特性,吸附和侵入 Hep-2細(xì)胞,細(xì)胞毒性分析以及免疫保護(hù)分析。結(jié)果表明,谷氨酰胺合成酶對SS2的毒力起到了非常重要的作用,是 SS2的一個(gè)重要的毒力因子。

4 其他類的毒力因子

Wilson等[26]通過信號標(biāo)簽誘變技術(shù)發(fā)現(xiàn)了 22個(gè)可能和毒力有關(guān)的片段,其中 lin0523通過構(gòu)建基因缺失突變株發(fā)現(xiàn),缺失株對 5只實(shí)驗(yàn)兔沒有產(chǎn)生任何影響,而且該基因在強(qiáng)毒株中存在,在弱毒株中則發(fā)生結(jié)構(gòu)突變[27]。Zhang A.D.等[28]發(fā)現(xiàn) IgA1蛋白酶、重組的 IgA1蛋白酶,有良好的水解 IgA1的活性,對恢復(fù)期血清有高免疫反應(yīng)性,這個(gè)基因在大多數(shù)的致病菌株中存在,但是在非侵襲性的菌株中很少出現(xiàn)。Esgleas等[29]發(fā)現(xiàn)一種新的纖連蛋白結(jié)合蛋白,此蛋白與其他細(xì)菌的烯醇蛋白沒有很高的同源性,但是具有烯醇蛋白酶的活性,吸附阻斷實(shí)驗(yàn)證明烯醇蛋白酶對吸附和侵入腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞具有重要的作用。

綜上所述,豬鏈球菌 2型的毒力因子和致病機(jī)制已經(jīng)做了大量深入的研究,發(fā)現(xiàn)有些 SS2分離株雖然沒有主要毒力因子的存在但仍然具有致病性,而有些含有主要毒力因子但致病性卻很弱,說明 SS2的毒力因子存在與否和致病性之間沒有正相關(guān)聯(lián)系?？赡苁峭ㄟ^毒力因子之間的相互作用來產(chǎn)生致病性,也有可能是關(guān)鍵的毒力基因尚未發(fā)現(xiàn)。因此,各毒力因子的詳細(xì)作用還有待于進(jìn)一步的深入研究,加強(qiáng)對該病致病機(jī)理的深入認(rèn)識,為進(jìn)行更好的防控該病提供理論指導(dǎo)。

[1] H ILL J E,GOTTSCHALK M,BROUSSEAU R,et al.Biochem ical analysis,cpn60 and 16S rDNA sequence data indicate that Streptococcus suis serotypes 32and 34,isolated from pigs,are Streptococcus orisratti[J].VetMicrobiol,2005,107(1-2):63-69.

[2] TANG J,WANG C,FENG Y,et al.Streptococcal toxic shock synd rome caused by Streptococcus suis serotype 2[J].PLoS Med,2006,3(5):151.

[3] LUN Z R,WANG Q P,CHEN X G,etal.Streptococcus suis:an emerging zoonotic pathogen[J].Lancet Infect Dis,2007,7(3):201-209.

[4] SMITH HED E,VRIESR,VAN′TSLOT R,etal.The cps locus of Streptococcus suis serotype 2:genetic determinant for the synthesis of sialic acid[J].Microbial Pathogenesis,2000,29(2):127-134.

[5] CHARLAND N,HAREL J,KOBISCH M,etal.Streptococcus suis serotype 2mutants deficient in capsular expression[J].Microbiology,1998,144(2):325-332.

[6] SMITH H E,DAMMAN M,VAN DER VELDE J,et al.Identification and characterization of the cps locus of Streptococcus suis serotype 2:the capsule protects against phagocytosis and is an important virulence factor[J].Infection and Immunity,1999,67(4):1 750-1 756.

[7] 曾巧英,陸承平.豬鏈球菌2型溶菌酶釋放蛋白的黏附作用[J].南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2002,25(4):67-71.

[8] VECHT U,STOCKHOFE-ZURWIEDEN N,TETENBURG B J,etal.Viru lence of Streptococcussuis type 2 formice and pigs appeared host-specific[J].VetMicrobiol,1997,58(1):53-60.

[9] WISSELINK H J,SMITH H E,STOCKHOFE-ZURWIEDEN N,et al.Distribution of capsular types and production ofmuramidase-released protein(MRP)and extracellular factor(EF)of Streptococcus suis strains isolated from diseased pigs in seven European countries[J].Veterinary Microbiology,2000,74(3):237-248.

[10] NORTON PM,ROLPH C,WARD PN,et al.Epithelial invasion and cell lysis by virulent strains of Streptococcus suis is enhanced by the presence of suilysin[J].Fems Immunol Med Mic,1999,26(1):25-35.

[11] LALONDEM,SEGURA M,LACOUTURES,et al.Interactions between Streptococcussuis serotype 2 and different epithelial cell lines[J].Microbiol,2000,146(8):1 913-1 921.

[12] WISSELINK H J,VECHTU,STOCKHOFE-ZURWIEDEN N,etal.Protection of pigs against challengewith virulent Streptococcus suis serotype Z strains by amuramidase-released protein and extracellu lar factor vaccine[J].Veterinary Record,2001,148:473-477.

[13] DEGREEFF A,BUYSH,VERHAARR,etal.Contribution of fibronectin-binding protein to pathogenesis of Streptococcus suis serotype 2[J].Infection and Immunity,2002,70(3):1 319-1 325.

[14] TANC,LIUM,JIN M,etal.The key virulence-associated genes of Streptococcus suis type 2are upregulated and differentially exp ressed in vivo[J].FemsMicrobiology Letters,2008,278(1):108-114.

[15] SMITH H E,BUIJSH,W ISSELINK H J,etal.Selection of virulence-associated determinants of Streptococcus suis serotype 2 by in vivo complementation[J].Infection and Immunity,2001,69(3):1 961-1 966.

[16] 祝昊丹,顧宏偉,陸承平.體內(nèi)表達(dá)新基因 trag在豬鏈球菌的分布及其免疫反應(yīng)性分析[J].微生物學(xué)報(bào),2008,48(12):1 642-1 648.

[17] ZHANG H,FAN H,LU C.Identification of a Novel Virulence-Related Gene in Streptococcus suis Type 2 Strains[J].Curr Microbiol,2010,61(6):494-499.

[18] OKWUMABUA O,PERSAUD JS,REDDY PG.Cloningand characterization of the gene encoding the glutamate dehydrogenase of Streptococcus suis serotype 2[J].Clin Diagn Lab Immunol,2001,8(2):251-257.

[19] FONTAINEM C,PEREZ-CASAL J,WILLSON P J.Investigation of anovel DNaseof Streptococcus suis serotype 2[J].Infect Immun,2004,72(2):774-781.

[20] 段志濤,何孔旺,張雪寒,等.豬鏈球菌 2型次黃嘌呤核苷酸脫氫酶基因的克隆與鑒定[J].微生物學(xué)報(bào),2006,46(5):730-733.

[21] HENDRIKSENW T,KLOOSTERMAN TG,BOOTSMA H J,et al.Site-specific contributions of glutam ine-dependent regulator GlnR and GlnR-regulated genes to virulence of Streptococcus pneumoniae[J].Infect Immun,2008,76(3):1 230.

[22] KLOOSTERMAN TG,HENDRIKSENW T,BIJLSMA J J,etal.Regu lation of glutamine and glutamatemetabolism by GlnR and GlnA in Streptococcus pneumoniae[J].JBiol Chem,2006,281(35):25 097-25 109.

[23] TAMURA G S,NITTAYAJARN A,SCHOENTAG D L.A glutamine transportgene,glnQ,is required for fibronectin adherence and virulence of group B strep tococci[J].Infect Immun,2002,70(6):2 877-2 885.

[24] TULLIUSM V,HARTH G,HORWITZM A.Glutamine synthetase GlnA1 is essential for growth ofMycobacterium tuberculosis in human THP-1macrophages and guinea pigs[J].In fect Immun,2003,71(7):3 927-3 936.

[25] SI Y H,YUAN F Y,CHANG H T,et al.Contribution of glutam ine synthetase to the virulence of Streptococcussuis serotype 2[J].Veterinary Microbiology,2009,139(1-2):80-88.

[26] WILSON T L,JEFFERS J,RAPP-GABRIELSON V J,et al.A novel signature-tagged mutagenesis system for Streptococcus suis serotype 2[J].Veterinary Microbiology,2007,122(1-2):135-145.

[27] LIP,LIU J,ZHU L,et al.VirA:A virulence-related gene of Streptococcus suis serotype 2[J].Microb Pathog,2010,49(5):305-310.

[28] ZHANG A D,MU X F,CHEN B,et al.Identification and characterization of IgA 1 protease from Streptococcus suis[J].Veterinary Microbiology,2010,140(1-2):171-175.

[29] ESGLEASM,LIYY,HANCOCK M A,et al.Isolation and characterization of alpha-enolase,a novel fibronectin-binding protein from Streptococcus suis[J].Microbiology,2008,154(9):2 668-2 679.

(責(zé)任編輯:石瑞珍)