大腸桿菌耐藥機(jī)制中激活外排泵和減少攝入量的研究進(jìn)展

楊 峰,邢艷蘋(píng),王 瑜,雷連成

(吉林大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院,吉林長(zhǎng)春,130062)

發(fā)現(xiàn)和使用抗生素一直是 20世紀(jì)重大的科學(xué)成就之一。在應(yīng)用抗生素的早期,細(xì)菌感染被認(rèn)為是可以攻克的。被感染的切口和創(chuàng)傷已經(jīng)不再威脅生命,各種細(xì)菌性疾病,如梅毒、霍亂也被認(rèn)為已經(jīng)根除。然而,抗生素的廣泛使用促使耐藥性病原體的產(chǎn)生,其中包括多藥耐藥菌株的出現(xiàn)。耐藥性迅速蔓延,特別是在各種細(xì)菌之間能夠密切接觸的醫(yī)院,它們?cè)诮佑|的過(guò)程中傳播著各自的耐藥性。由于細(xì)菌間耐藥性基因的傳遞轉(zhuǎn)移,使耐藥性也蔓延到周?chē)纳鐓^(qū)。

致病菌耐藥性是新出現(xiàn)的一種全球性危機(jī),理解耐藥機(jī)制對(duì)于設(shè)計(jì)和開(kāi)發(fā)新的治療策略至關(guān)重要[1,2]。藥物分子的通透性屏障和外排泵激活是致病菌導(dǎo)致疾病爆發(fā)的兩個(gè)重要機(jī)制,這表明這些機(jī)制可能是是新藥物設(shè)計(jì)的重要靶位[3]。外排泵和攝入量減少的協(xié)同作用是在外膜外排泵和攝入量的通透性屏障倍增的明顯機(jī)制,導(dǎo)致臨床大腸桿菌耐藥的固有的或者獲得的高水平耐藥。

細(xì)菌藥物外排系統(tǒng)在消耗能量的前提下泵出細(xì)菌體內(nèi)非自身化學(xué)成分或結(jié)構(gòu)的化合物,而并不改變藥物分子或是使其降解。幾種現(xiàn)有的細(xì)菌基因序列的分析表明,在任意所給的細(xì)菌中已知和假定的藥物外排轉(zhuǎn)運(yùn)體占細(xì)菌體內(nèi)全部運(yùn)轉(zhuǎn)體的 6%～8%[4～6]。

在大多數(shù)情況下,多藥外排轉(zhuǎn)運(yùn)體是由染色體編碼的,因此不容易在細(xì)菌間轉(zhuǎn)移。然而,在革蘭氏陽(yáng)性和陰性菌的可動(dòng)因子中都發(fā)現(xiàn)過(guò)(轉(zhuǎn)運(yùn)體基因)。許多情況下耐藥的產(chǎn)生是由于減少攝入量與藥物外輸間的協(xié)同作用。

1 外排系統(tǒng)

1.1 主易化家族(MFS)

催化藥物外排的 MFS家族蛋白隸屬 3個(gè)亞科,藥物/H逆向轉(zhuǎn)運(yùn)子 DHA1,DHA2,DHA3。DHA1和DHA2蛋白家族在原核生物和真核生物界是普遍存在的,并且能夠外排不同結(jié)構(gòu)的多種藥物,范圍很廣。

DHA 1家族的成員泵出糖類(lèi)、多胺類(lèi)、解偶聯(lián)劑、單胺類(lèi)、乙酰膽堿、百草枯和丙酮醛。與此相反,DHA 2家族成員具有更加嚴(yán)格的底物特異性,轉(zhuǎn)運(yùn)底物包括膽鹽和染料。DHA3家族只在原核細(xì)胞中發(fā)現(xiàn),已知能外排抗生素[7],如:大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)和四環(huán)素。

1.2 ATP結(jié)合盒超家族(ABC)

ABC轉(zhuǎn)運(yùn)家族同時(shí)包含吸收與外排運(yùn)輸系統(tǒng)。這個(gè)家族的成員利用 ATP水解產(chǎn)生的能量運(yùn)輸多種物質(zhì),如糖類(lèi)、氨基酸、離子、藥物、多糖和蛋白質(zhì)。ABC家族包括內(nèi)膜蛋白(推測(cè)是細(xì)胞膜上膜孔蛋白)和具有 ATP酶活性胞漿蛋白。細(xì)菌 ABC透明質(zhì)酸酶通常包含 6個(gè) TMS,每個(gè)都以異源二聚體的形式成對(duì)連接到膜上[8～10]。兩個(gè) ATP酶亞基在細(xì)胞內(nèi)膜的胞質(zhì)面與透明質(zhì)酸酶相關(guān)聯(lián),形成一個(gè)功能轉(zhuǎn)運(yùn)體。細(xì)菌中屬于 ABC家族的藥物外排泵是少有的,研究得最好的是乳酸乳球菌的 Lm rA泵。當(dāng)前屬于 ABC超家族的有 21個(gè)原核外排體系統(tǒng)。

1.3 小多藥耐藥家族(SMR)

小多藥耐藥家族。與名稱相符,這一家族轉(zhuǎn)運(yùn)子包含約 110個(gè)氨基酸殘基,4個(gè)跨膜區(qū),通過(guò)質(zhì)子動(dòng)力勢(shì)供能。由于它們分子量較小,SMR蛋白最初以三聚體的形式執(zhí)行功能。然而,最近的一項(xiàng)研究表明,它們實(shí)際上是以四聚體的形式存在的。這個(gè)家族的特異性外排泵包括金葡菌的 Smr外排泵和大腸桿菌的 Em rE外排泵,泵出染料,藥物和陽(yáng)離子。

1.4 耐藥結(jié)節(jié)化細(xì)胞分化族(RND)

革蘭氏陰性菌中,RND泵由包含 12個(gè)跨膜區(qū)的 RND膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白與一個(gè)周質(zhì)融合蛋白和一個(gè)外膜通道蛋白組成。RND轉(zhuǎn)運(yùn)子的拓?fù)鋵W(xué)特點(diǎn)是在跨膜片段 1-2,7-8之間有兩個(gè)大的親水性片段,且 N末端和 C末端之間無(wú)對(duì)稱外形。1個(gè)分支桿菌球菌 RND只有 6個(gè)跨膜區(qū),沒(méi)有內(nèi)部重復(fù)序列。很可能蛋白是作為二聚體,異二聚體或與其它蛋白協(xié)同發(fā)揮作用。這類(lèi)家族中研究得最好的是大腸桿菌的 AcrAB-tolc系統(tǒng)和銅綠假單胞菌的 MexAB-Oprm系統(tǒng),已知這 2個(gè)外排泵外排抗生素、重金屬、染料、去污劑、溶劑以及許多其它底物。

1.5 多藥及毒性化合物外排族(MATE)

以前認(rèn)為 MATE家族蛋白屬于 MFS超家族,現(xiàn)在人們將它們看做一個(gè)單獨(dú)的家族,因?yàn)殡m然具有相似的膜拓?fù)浣Y(jié)構(gòu),然而與 MFS蛋白并沒(méi)有序列同源性。副溶血性弧菌的 NorM和其同系物大腸桿菌的 YdhE即屬于這一家族。這些蛋白長(zhǎng)約 450個(gè)氨基酸殘基,包含 12個(gè)跨膜區(qū)[11]。這一家族的蛋白以鈉離子梯度作為能量的來(lái)源外排陽(yáng)離子染料和喹諾酮類(lèi)藥。

2 大腸桿菌的 RND外排泵

大腸桿菌的基因組分析顯示存在著 7個(gè) RND轉(zhuǎn)運(yùn)子。迄今為止,其中的 5個(gè)已經(jīng)研究了其功能特點(diǎn),并被證實(shí)參與藥物的外排:AcrAB,AcrEF,AcrD,YhiUV,和 MdtABC。目前進(jìn)行研究的所有大腸桿菌RND泵都發(fā)現(xiàn)其與 TOLC外膜通道相關(guān)聯(lián)。AcrAB-Tolc已經(jīng)被鑒定為此類(lèi)菌中最突出的藥物外排泵。而且它具有 RND家族泵的典型特點(diǎn)。敲除 AcrEF,YhiUV,MdtABCD的實(shí)驗(yàn)顯示,野生型大腸桿菌對(duì)藥物的敏感性并未改變,這說(shuō)明這些泵在大腸桿菌抗生素抗性上并沒(méi)有顯著的作用。

AcrAB-Tolc系統(tǒng)顯示出了非常廣的底物特異性[12]。它的底物包括吖啶黃,?-內(nèi)酰胺類(lèi),膽鹽,氯霉素,結(jié)晶紫,溴化乙啶,脂肪酸,大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)抗生素,有機(jī)溶劑,氟喹諾酮和 SDS。AcrD泵最初被認(rèn)為是作為一個(gè)單一組分泵而排出氨基糖苷類(lèi)藥物,但是最近更多的數(shù)據(jù)表明實(shí)際上它需要與 AcrA和 Tolc一同排出膽鹽,新生霉素和氨基糖苷類(lèi)物質(zhì)。AcrEF泵不存在于野生型大腸桿菌,但是在缺乏 AcrAB泵的抗氟喹喏酮突變體中表達(dá)。這個(gè)外排系統(tǒng)也能引起大腸桿菌對(duì)溶劑的抗性。有趣的是,AcrF蛋白在與 AcrA和 Tolc同作用時(shí)排出溶劑,說(shuō)明組成 RND的組分之間可能是可以互換的。

2.1 RND外排泵的結(jié)構(gòu)和功能

2.1.1 外膜通道蛋白 OprM由 3個(gè)蛋白分子組合而成,形成一個(gè)獨(dú)特的結(jié)構(gòu),構(gòu)成一個(gè)連續(xù)穿過(guò)周質(zhì)空間和外排的通道。每個(gè)蛋白單體提供 4個(gè)鏈以形成桶狀,由此組成12個(gè)鏈的 β2桶狀結(jié)構(gòu)域,此結(jié)構(gòu)位于一個(gè)由 12個(gè)鏈盤(pán)繞的穿過(guò)周質(zhì)空間的 α2螺旋孔道之上[13]。

2.1.2 RND內(nèi)膜轉(zhuǎn)運(yùn)子 AcrB轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的高溶解度結(jié)晶結(jié)構(gòu)顯示,其為 MexB同族體。3個(gè) AcrB原體聚合成一同源三聚體結(jié)構(gòu),包括 3個(gè)不同的區(qū)域:1個(gè)跨膜區(qū),1個(gè)孔道區(qū),1個(gè) Tolc結(jié)合區(qū)?？椎绤^(qū)與 Tolc結(jié)合區(qū)向周質(zhì)中突出一個(gè) 7 nm的部分,足夠與 Tolc末端自然接觸形成通道[14]。相鄰原體周質(zhì)區(qū)之間的孔腔被認(rèn)為是底物結(jié)合區(qū)。每個(gè)原體都由一突出的帽樣結(jié)構(gòu)和一含有 12個(gè)跨膜螺旋結(jié)構(gòu)的跨膜區(qū)域組成。MexB和 MexD的膜拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)與 12個(gè)跨膜片斷模型一致,在模型中,氨基和羧基端位于內(nèi)膜的胞質(zhì)面,第 1和第 4周質(zhì)循環(huán)各有 1個(gè)氨基酸殘基的親水區(qū)域,這 2個(gè)循環(huán)與膜融合蛋白和(或)外膜蛋白相互作用。

2.1.3 膜融合蛋白 綠假單胞菌的 MexA結(jié)構(gòu)顯示它是以一個(gè)環(huán)狀 C結(jié)構(gòu)與外膜通道蛋白和 RND轉(zhuǎn)運(yùn)子相互作用。同時(shí)也存在幾種與 MexA與 OprM和 MexB相互作用不同的模型。無(wú)論其中膜融合蛋白的具體作用是什么,總之,其在外排泵的組成和功能上是不可或缺的。

2.2 RND外排泵的組裝

一項(xiàng)最近的研究顯示,在底物分子存在或不存在的情況下,AcrA,AcrB和 TolC等 3種蛋白組裝成具有功能性的 AcrAB-TolC泵。然而,這與我們?cè)趯?shí)驗(yàn)室中觀察到的銅綠假單胞菌 MexJK-OMP泵的功能性裝配具有底物依賴性不同。在三氯森存在的情況下,MexJK與 OpmH裝配成 MexJK-OpmH三氯森外排泵。相反的,在乙琥紅霉素存在的情況下,MexJK與 OprM裝配成 MexJK-OprM乙琥紅霉素外排泵。這說(shuō)明外排泵結(jié)構(gòu)在不同 RND家族蛋白的組成機(jī)制上存在巨大的多樣性。這是有意義的,因?yàn)殂~綠假單胞菌有 50%的 RND外排泵操縱子并不編碼自身的外膜通道蛋白,因此必須依賴其它外膜通道蛋白的表達(dá),比如 OprM家族,來(lái)組裝成具有功能性的外排泵[15]。

2.3 RND外排泵的固有功能

不同 RND泵的固有功能依然是一個(gè)需要探討的話題。人們最初認(rèn)為這些泵是革蘭氏陰性菌抵抗環(huán)境抗菌劑和其它毒素的一種防御機(jī)制[16,17]。然而,對(duì)它們種系發(fā)生的研究指出,在革蘭氏陽(yáng)性菌、古細(xì)菌甚至人類(lèi)中存在 RND的同系物。AcrAB敲除株對(duì)膽鹽具有高度敏感性,說(shuō)明大腸桿菌中的 AcrAB泵對(duì)膽鹽有較高的親和力。大腸桿菌的原屬地在腸道內(nèi),環(huán)境中充斥著膽鹽,因此外排膽鹽是其自身的一種防護(hù)機(jī)制。另外,外排泵的固有功能還包括:移除毒素、代謝產(chǎn)物以及緩沖有毒代謝產(chǎn)物對(duì)機(jī)體的沖擊,可能還包括細(xì)胞與細(xì)胞間信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)時(shí)信號(hào)分子的傳遞。

2.4 RND外排泵基因表達(dá)的調(diào)控

編碼外排泵不同組分的操縱子都包含 1個(gè)連鎖調(diào)節(jié)基因。例如,大腸桿菌 acrR與 acrAB分別轉(zhuǎn)錄,編碼 1個(gè) TetR抑制家族的抑制物。眾所周知,AcrR同時(shí)抑制其自身和 acrAB的轉(zhuǎn)錄。AcrR在大腸桿菌臨床菌株獲得氟喹喏酮類(lèi)耐藥性中起到的作用是中國(guó)的一項(xiàng)研究證實(shí)的[18～20]。該研究在 acrR突變和 acrAB過(guò)表達(dá)引起的高水平氟喹喏酮類(lèi)耐藥之間找到了聯(lián)系。顯示出 AcrR的主要作用是阻礙 acrAB表達(dá)。

研究表明,大部分銅綠假單胞菌的 RND多藥外排系統(tǒng)通過(guò)連鎖調(diào)劑基因調(diào)控,這些基因編碼阻遏物或激活物。mexAB-OprM操縱子上游的 DNA序列有一開(kāi)放讀碼框(ORF),編碼蛋白 MexR,這是一轉(zhuǎn)錄抑制蛋白,屬于MarR抑制家族,與 mexAB-OprM的轉(zhuǎn)錄反方向?；?mexR的失活導(dǎo)致 MexAB-OprM的過(guò)度表達(dá)和多重耐藥的表現(xiàn)。

高表達(dá) MexAB-OprM的臨床株常帶有 mexR的突變。mexCD-OprJ的調(diào)節(jié)與 NfxB抑制蛋白有關(guān),由定位于 mexCD-OprJ操縱子上游的 n fxB基因編碼。囊性纖維變性菌株長(zhǎng)期接觸環(huán)丙沙星導(dǎo)致 nfxB突變,表達(dá) MexCD-OprJ。mexEF-OprN由屬于轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子的 LysR家族的 Mex T正調(diào)節(jié)。與其它調(diào)節(jié)子相比,作為唯一一個(gè)正調(diào)因子,其作用機(jī)制是獨(dú)特的?；?mex T定位于 mexEF2oprN的上游,兩者轉(zhuǎn)錄同方向。當(dāng) Mex T過(guò)度表達(dá)時(shí),誘導(dǎo) mexEF2op rN操縱子的表達(dá)和 OprD(外膜通道)的低表達(dá)。Mex-EF2OprN過(guò)度表達(dá)的 nfxC突變株的突變位點(diǎn)不在 mex T基因上,提示有其它基因通過(guò) mexT控制 Mex-EF-OprN的表達(dá)。

各種外排泵的表達(dá)也受不同的整體調(diào)控子調(diào)節(jié),其中研究得最好的是大腸桿菌的 AcrAB-TolC外排泵。到目前為止,幾種整體轉(zhuǎn)錄激活因子,包括 MarA,SoxS和 Rob均參與了該泵的表達(dá)調(diào)控。Mar基因座由 marRAB操縱子和 marC組成。MarR是抑制物,MarA是激活物,MarB和 MarC的功能依然不清楚。

MarA是 AraC轉(zhuǎn)錄激活因子家族的成員,除了激活自身轉(zhuǎn)錄外,還激活其它大量基因。包括 acrAB,tolC和 micF。下調(diào) ompF的表達(dá),OMP通道為各種抗生素進(jìn)入菌體的途徑。MarA在抗菌劑存在的條件下使 Ompf低表達(dá),AcrAB-TolC過(guò)表達(dá),為大腸桿菌提供了一個(gè)高效抗菌的機(jī)制?？傮w而言,MarA激活 mar調(diào)節(jié)子的表達(dá),包括 acrAB,tolC和 marRAB[21,22]。而 MarR通過(guò)抑制 MarA來(lái)抑制 mar調(diào)節(jié)子的表達(dá)。如大腸桿菌,在產(chǎn)氣腸桿菌中 marA過(guò)表達(dá)導(dǎo)致耐藥性增加,極可能是由于膜孔蛋白表達(dá)減少而主動(dòng)外排增加。

3 克服外排

隨著 RND運(yùn)載體在革蘭氏陰性菌臨床抗生素耐藥性產(chǎn)生的重要意義被證明,這些外排泵在藥物開(kāi)發(fā)著手點(diǎn)上起著重要的作用,并且作為真正的藥物靶位促進(jìn)聯(lián)合治療的發(fā)展。這些泵的抑制劑可能在不同的層面上得以實(shí)現(xiàn):通過(guò)抑制與藥物結(jié)合的內(nèi)膜泵;或者通過(guò)抑制多組分泵的不同組成成分,或者針對(duì)外排泵的能量來(lái)源,或者通過(guò)作用于調(diào)節(jié)外排泵表達(dá)的調(diào)控途徑來(lái)抑制外排泵。

在過(guò)去的 10年也發(fā)現(xiàn)了一系列的外排泵抑制劑。第一個(gè)廣譜 RND泵抑制劑是 MC-207,110(苯丙氨酸精氨酸 b萘胺)。這種抑制劑使左氧氟沙星對(duì)銅綠假單胞菌的活力增高 8倍,對(duì)MexAB-OprM過(guò)表達(dá)株活力增加 64倍。重要的是,EPIs減少了左氧氟沙星自發(fā)抗性菌株的發(fā)生,并且對(duì)綠膿桿菌感染的動(dòng)物模型有效。類(lèi)似的化合物被證明泵抑制產(chǎn)氣腸桿菌和彎曲桿菌屬的外排泵。人們認(rèn)為這類(lèi)化合物是通過(guò)抑制抗生素與泵之間的特異性結(jié)合位點(diǎn)來(lái)發(fā)揮作用的。Benastatins從一種放線菌的發(fā)酵液中得到的另一種化合物能夠有效對(duì)抗銅綠假單胞菌 MexAB-OprM的表達(dá)。其它細(xì)菌不同來(lái)源的 EPIs也已經(jīng)被鑒定出來(lái)。幾個(gè)四環(huán)素衍生物能夠抑制 TetB外排泵。其中最強(qiáng)大的是一種強(qiáng)力霉素的衍生物——13-CPTC。與上述抑制劑相反,13-CPTC具有自身的抗菌特性,能夠作用于脂多糖缺陷型大腸桿菌和金葡菌。13-CPTC與強(qiáng)力霉素結(jié)合使強(qiáng)力霉素的最小抑菌濃度值降低到原來(lái)的 1/10～1/4。從植物中分離出來(lái)的抑制劑并不顯示內(nèi)在的抗菌活性,但是能夠通過(guò)抑制 NorA泵增強(qiáng)氟哌酸對(duì)金葡菌的效應(yīng)。

抑制劑和目前的抗菌類(lèi)藥聯(lián)合治療能夠恢復(fù)耐藥性細(xì)菌對(duì)抗生素的敏感性。然而,這種途徑存在風(fēng)險(xiǎn):它對(duì)真核細(xì)胞具有潛在的不良影響,比如毒性,比如對(duì)真核生物結(jié)構(gòu)和功能相似性運(yùn)轉(zhuǎn)體的抑制。

繞過(guò)外排泵也可能有可行的辦法?？梢詮拈_(kāi)發(fā)新藥上入手:開(kāi)發(fā)不在這些外排泵作用范圍內(nèi)的新藥。事實(shí)上,一些較新的氟喹喏酮類(lèi)似乎不在革蘭氏陰性菌的主要外排泵的作用范圍,然而目前還不清楚藥物活性的增加是由于對(duì)靶位的高親和力還是對(duì)這些泵的低親和力。正如前面所說(shuō)的,總是存在抗生素接觸誘導(dǎo)產(chǎn)生新的外排泵的風(fēng)險(xiǎn)。GRA-936就是一個(gè)例子。GRA-936不是 Tet泵的作用底物,然而,甘氨酰環(huán)素是許多革蘭氏陰性菌的 RND泵底物[23～25],包括銅綠假單胞菌、肺炎克雷伯菌、奇異變形桿菌和摩根菌。這些因素使它對(duì)革蘭氏陰性菌無(wú)效。脂多糖的存在是脂雙分子層對(duì)輸水物質(zhì)如抗生素和去污劑不具滲透性的原因。脂多糖在對(duì)抗抗生素時(shí)起到屏障的作用,大腸桿菌和美國(guó)副傷寒沙門(mén)氏菌類(lèi)脂 A和脂多糖中心缺陷株較野生株對(duì)乙琥紅霉素、羅紅霉素、克拉霉素和阿奇霉素的敏感性增加 4倍。

4 結(jié)論和討論

減少外膜的通透性也就減少了抗生素的吸收導(dǎo)致低水平的耐藥性。在藥物外排泵存在的情況下,耐藥性在減少射入和主動(dòng)外排協(xié)同作用下被成倍放大,形成高水平的耐藥性?；蛐蛄蟹治霰砻?這些外排泵分布較廣,這樣預(yù)示著它們可在病原體范圍內(nèi)進(jìn)行基因交流。實(shí)驗(yàn)證明確實(shí)如此。需要特別注意的是,這些外排泵廣泛的底物特異性,可以抵消新藥的作用效果。比如替加環(huán)素,甚至是實(shí)驗(yàn)試劑,大部分都是大腸桿菌 E.coliAcrAB-TolC泵的底物[26～28]。外排泵既影響了藥物有效性,同時(shí)卻又促進(jìn)藥物開(kāi)發(fā)的進(jìn)展。

5 展 望

新療法不僅包括避開(kāi)外排泵提高新藥的滲透性,還包括應(yīng)用廣譜外排泵抑制劑提高現(xiàn)有的抗菌劑的效力?；蚪M分析的最新進(jìn)展提示,在分子結(jié)構(gòu)的可行性和對(duì)功能以及外排系統(tǒng)調(diào)控方面的深入理解將推動(dòng)以外排泵為靶位點(diǎn)的新藥的開(kāi)發(fā)[29～31]。

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(責(zé)任編輯:朱寶昌)