豬繁殖與呼吸障礙綜合征(PRRS)診斷方法研究進(jìn)展

邱美珍，傅勝才，周志雄 ，周望平，杜麗飛，王紅兵，曾 勝

(1.湖南省畜牧獸醫(yī)研究所，湖南 長沙 410131；2.湖南省桃江縣高橋鄉(xiāng)動物防疫站，湖南 桃江 413400;3.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)，湖南 長沙 410128)

豬繁殖與呼吸綜合征 (PRRS)于1987年首先報道于美國，現(xiàn)已遍及全球主要養(yǎng)豬國家和地區(qū)。我國1995年首次暴發(fā)此病并從PRRS疑似病例中分離到PRRSV。目前根據(jù)臨床和血清學(xué)調(diào)查，該病在我國普遍存在，而且近年來還呈流行態(tài)勢，新的變異病毒株層出不窮，加之新老疫病交替感染，使生豬疫情越來越復(fù)雜，多病因混合感染導(dǎo)致疫病流行強(qiáng)度和危害程度顯著增加，給養(yǎng)豬業(yè)造成毀滅性破壞，如何快速及時診斷PRRS成了畜牧業(yè)的研究熱點。本文就臨床診斷，血清學(xué)診斷和病原診斷研究進(jìn)展作一綜述。

1 臨床診斷

1.1 臨床癥狀

PRRSV可以引起各種年齡的豬群發(fā)生疾病，但是其表現(xiàn)各不相同，其中最為典型的兩種臨床表現(xiàn)就是母豬繁殖障礙和斷奶仔豬呼吸系統(tǒng)疾病。同時該綜合征又以急性、慢性、亞臨床癥狀三種表現(xiàn)形式更為普遍。臨床癥狀通常在感染后的2～7天表現(xiàn)出來，維持大約1周。

母豬感染后臨床表現(xiàn)為發(fā)情期延遲、發(fā)情間期延長、受胎率降低、分娩率降低、厭食、發(fā)熱、嗜睡、呼吸困難、嘔吐、皮膚損傷與變色、早產(chǎn)（107～113天）、懷孕后期的流產(chǎn)、死胎、弱仔、木乃伊胎、無乳以及少數(shù)的死亡等；公豬感染了該病以后，精液品質(zhì)和產(chǎn)量都有降低；哺乳仔豬感染后，表現(xiàn)的臨床癥狀主要有快速的腹式呼吸、嗜睡、精神抑郁、斷奶前死亡率增加、二次感染發(fā)病率增加；保育仔豬感染后，表現(xiàn)為快速的不正常呼吸、打噴嚏、厭食、被毛粗亂、行動遲緩以及偶爾的死亡。關(guān)于呼吸道癥狀，在臨床上，許多感染豬有著嚴(yán)重的呼吸道癥狀，可是在實驗條件下卻很難復(fù)制呼吸道癥狀，這可能是由于PRRSV和細(xì)菌的脂多糖（LPS）產(chǎn)生協(xié)同作用，增強(qiáng)了感染豬只的呼吸道癥狀。

1.2 病理特點

PRRSV能引起豬只肺、胸腺、肝、扁桃體、脾、心、腎和淋巴結(jié)多系統(tǒng)感染，但是大體病變僅出現(xiàn)在幾個有限的組織器官（即呼吸系統(tǒng)和淋巴組織），新生豬和哺乳仔豬感染的特征性病變和顯微鏡下病變最為明顯。由于在野外的條件，PRRSV常常與一種或多種其他病原發(fā)生混合感染，病理變化更加復(fù)雜。新生豬和哺乳仔豬感染PRRSV后，肺呈紅褐色，不塌陷。淋巴結(jié)腫大，呈褐色，成為診斷PRRSV的標(biāo)志。在顯微鏡下，可以看到間質(zhì)性肺炎。腦、扁桃體、淋巴結(jié)和心臟的顯微鏡下檢查具有診斷學(xué)意義。還發(fā)現(xiàn)肺有不同程度的水腫，肺泡及肺泡膈水腫和炎性細(xì)胞浸潤，大腦軟腦膜及腦實質(zhì)毛細(xì)血管淤血，透明血栓形成。

2 血清學(xué)診斷的方法

2.1 免疫過氧化物酶單層實驗(IPMA)

1991年由Wensvoort等建立，至今仍是歐洲國家檢測該病的常用方法。IPMA應(yīng)用最早且使用廣泛，敏感性與特異性都較好，可以用于PRRSV的抗原檢測、病毒的鑒定、血清抗體的檢測。實驗主要在PAM、CL2621、MARC-145細(xì)胞上進(jìn)行，能在感染后6日血清中檢測到PRRSV抗體，具有較高的特異性。但是，該實驗終點判斷主觀性較強(qiáng)，且不利于自動化操作，不適合大規(guī)模的檢測。

2.2 間接熒光抗體試驗（IFA）

由Yoon等于1992年首次報道建立的?？梢杂肞AM、CL2621、MARC-145細(xì)胞培養(yǎng)物進(jìn)行IFA。該方法與IPMA相似，特異性和敏感性都較好，并且簡單易行，易于推廣，可以在感染后2～3周檢測出抗體，因此己經(jīng)成為歐美各國官方認(rèn)可的權(quán)威檢測方法之一。

2.3 酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）

由Albina等用PAM接種PRRSV培養(yǎng)制備陽性抗原，首次建立了檢測PRRSV抗體的間接ELISA。Takikawa等PRRSV接種MARC-145制備抗原，改進(jìn)了檢測PRRSV抗體的ELISA方法。Nodelijk G等比較了IPMA和ELISA方法用來檢測PRRSV的效果，通過實驗他們發(fā)現(xiàn)，IPMA能夠比ELISA早2～3d檢測出抗體，然而ELISA卻能在不損失特異性的基礎(chǔ)上提高敏感性，相比之下，ELISA更適合用來診斷PRRSV。目前，ELISA是檢測PRRS最常用的方法之一，主要是因為該方法經(jīng)濟(jì)簡便、檢測結(jié)果快、重復(fù)性好、相對客觀、能自動顯示結(jié)果、可以大批量的操作，便于大規(guī)模的檢疫。

2.4 血清中和試驗（SN）

檢測PRRSV特異性較好，但是中和抗體出現(xiàn)時間較遲，一般要在感染后4～6周出現(xiàn)。中和抗體比IFA抗體維持時間要長，一般可以維持半年以上，但是對于急性感染的敏感性較差，要求血清無污染，而且細(xì)胞培養(yǎng)工作量大，技術(shù)性強(qiáng)，目前僅僅限實驗室研究應(yīng)用。

2.5 乳膠凝集試驗（LAT）

王忠利用純化的PRRSV重組M蛋白致敏乳膠制成乳膠抗原，成功地將LAT用于PRRSV血清抗體的檢測。LAT具有良好的特異性。用LAT與國外IDEXX公司PRRSV抗體檢測試劑盒同時對76份豬血清樣本進(jìn)行檢測，結(jié)果表明LAT的特異性和敏感性均為95%，與IDEXX公司試劑盒的總符合率為87%，檢出率基本一致。因LAT具有操作簡便、快速、敏感性高、特異性強(qiáng)、價格低廉且可用于現(xiàn)場檢測等優(yōu)點，是一種適合基層獸醫(yī)單位檢測PRRSV血清抗體的新辦法。

3 病原學(xué)的診斷

3.1 病毒抗原檢測

檢測病毒抗原主要有免疫組織化學(xué)技術(shù)、免疫金技術(shù)和免疫熒光抗體染色技術(shù)。Halbur等率先建立檢測病豬PRRSV抗原的鏈酶親和素-生物素-免疫過氧化物酶方法，是診斷該病的最準(zhǔn)確的方法之一，也可以用于檢測抗原的總體分布。Magar等報道使用特異性單克隆抗體建立了檢測PRRSV抗原的免疫金銀染色法（IGSS），人工感染實驗表明該方法可于感染后幾天之內(nèi)從甲醛固定的感染組織中檢測到PRRSV抗原，具有較好的特異性和敏感性。1992年Benfield等制備了抗PRRSV核衣殼蛋白的單克隆抗體，這種抗體能與北美洲和歐洲的45株分離株反應(yīng)。表明該單抗是針對這些分離株的保守抗原決定簇，應(yīng)用異硫氰酸熒光素（FITC）標(biāo)記該單抗，建立了免疫熒光抗體技術(shù)并用于直接檢測仔豬肺組織中的抗原。

3.2 病毒核酸檢測

RT-PCR和原位雜交（ISH）均已成功用于PRRSV感染組織的和各種樣品核酸的檢測。Sur等以PRRSV的RNA為模板，應(yīng)用地高辛標(biāo)記法制備了特異性的cDNA探針，建立了檢測PRRSV的RNA原位雜交技術(shù)。該技術(shù)可以確定病毒感染時的細(xì)胞和組織嗜性，特別適用于研究目的，但是技術(shù)含量高，難以用于臨床的診斷。

RT-PCR現(xiàn)在己經(jīng)廣泛用于PRRSV實驗室檢測，是由Saurez等根據(jù)LV株的ORF7的序列，設(shè)計一對特異性的引物而建立起來的。研究表明，RT-PCR技術(shù)可以用于肺泡巨噬細(xì)胞、血清、血漿等樣品的PRRSVRNA的檢測。具有高度的特異性和敏感性，檢測速度快，可檢測到組織培養(yǎng)物及精液中30個PRRSV感染單位，敏感性是病毒分離的10倍。該法可以避免散毒的危險，尤其適合沒有PRRSV感染的國家的檢疫。對于一些特殊樣品，如對細(xì)胞有毒性（精液）、已經(jīng)滅活的樣品、己被PRRSV抗體中和的樣品和病毒含量很低的樣品，使用RT-PCR技術(shù)檢測是一種很好的方法。

3.3 病毒的分離

病毒分離是診斷該病最為準(zhǔn)確的診斷方法?？蓮牟煌慕M織器官中否可以分離到PRRSV病毒，最好采用死胎或者活產(chǎn)仔豬的肺、心、腦、腎、肝和脾等組織器官勻漿混合物，懷孕后期流產(chǎn)胎兒的血清也是很好的分離樣品。血清和肺組織分離成功率最高，尤其是血清，因其采集方便，所以成為最主要的樣本采集對象。另外，從豬群來看，最好是從保育豬和育肥豬采集病料進(jìn)行病毒分離，因為PRRSV病毒的感染主要發(fā)生在這一時期?，F(xiàn)在用于PRRSV的分離和體外大量培養(yǎng)的細(xì)胞主要有豬肺泡巨噬細(xì)胞（PAM）、非洲綠猴腎細(xì)胞傳代細(xì)胞系CL2621和MARC-145（由MA104細(xì)胞進(jìn)一步克隆而來）。PAM是PRRSV分離的最為敏感的細(xì)胞，MARC-145細(xì)胞對PRRSV具有高度的敏感性，可供多種毒株分離。不同毒株在不同的細(xì)胞上生長情況各不相同，有些毒株在第一代接種后需要3～5天才產(chǎn)生CPE，而有些則需要盲傳幾代后才能有CPE出現(xiàn)，還有些毒株即使在敏感細(xì)胞上也不能產(chǎn)生CPE。因此在進(jìn)行病毒分離的同時，還應(yīng)該結(jié)合IFA和IPMA等方法進(jìn)行檢測，從而使結(jié)果更加可靠。

4 結(jié)語

目前，臨床上由于PRRS的癥狀復(fù)雜多樣、無特征性癥狀，病變不明顯、不典型，且常常繼發(fā)、并發(fā)其它疾病，故臨床診斷只能作為初步診斷。確診需進(jìn)一步采取病料進(jìn)行病毒的分離鑒定、血清學(xué)和病原學(xué)診斷。雖然病毒的分離是診斷該病最為準(zhǔn)確的方法，但是有時有些毒株即使在敏感細(xì)胞上也不能增殖，而且有些毒株僅僅只能在特定的細(xì)胞上才能增殖，這就使實驗室診斷的可靠性也值得懷疑。因此，有效的診斷方法還有待進(jìn)一步研究。

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