豬霉形體體外藥物敏感性試驗(yàn)

李曉云,賈杏林

（湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410128）

豬霉形體（Mycoplasma suis，M.suis）是豬附紅細(xì)胞體病病原，其感染率極高，可導(dǎo)致貧血、黃疸、生長(zhǎng)發(fā)育遲緩、免疫功能受損、對(duì)豬的其他呼吸道和腸道疾病的易感性增加。豬霉形體的感染會(huì)誘發(fā)很強(qiáng)的免疫反應(yīng)，但對(duì)動(dòng)物無(wú)明顯的保護(hù)作用，因此對(duì)發(fā)病動(dòng)物的治療主要依賴藥物。已報(bào)道過(guò)的臨床用藥種類繁多，但是在已經(jīng)研究過(guò)藥物中未發(fā)現(xiàn)能持續(xù)清除豬霉形體的藥物，對(duì)首選治療藥物一直存在爭(zhēng)議，結(jié)果導(dǎo)致抗生素濫用，造成附紅體菌株耐藥性增加、動(dòng)物性食品的藥物殘留等問(wèn)題。本研究在李曉云等建立的豬霉形體體外無(wú)細(xì)胞培養(yǎng)的基礎(chǔ)上，通過(guò)直接觀察藥物作用效果、比較染蟲(chóng)率、溶血率等的變化評(píng)價(jià)了強(qiáng)力霉素等8種抗生素對(duì)豬霉形體的殺滅作用，以期為高效安全藥物篩選、豬附紅細(xì)胞體病的防治等提供一定的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病原及紅細(xì)胞

無(wú)菌靜脈采集疑似患附紅細(xì)胞體病豬血，檸檬酸三鈉抗凝，對(duì)采集的紅細(xì)胞涂片后進(jìn)行Giemsa染色鏡檢，參考Hoelzle等的方法進(jìn)行PCR鑒定。以上方法鑒定為豬霉形體陽(yáng)性的血樣低溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 培養(yǎng)基和主要試劑

試驗(yàn)用培養(yǎng)液的配制參考文獻(xiàn)3。強(qiáng)力霉素、土霉素 （含量大于99%）、酒石酸泰樂(lè)菌素（1mg效價(jià)不少于800泰樂(lè)菌素單位），購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；氟苯尼考注射液，江蘇金牧王藥業(yè)有限公司；硫酸新霉素、慶大霉素、鏈霉素、青霉素為Amresco進(jìn)口分裝。將上述藥品用適宜的方法配制成相應(yīng)的濃度貯存液，過(guò)濾除菌，－20℃保存?zhèn)溆?，臨用前用培養(yǎng)液稀釋成相應(yīng)濃度的應(yīng)用液（見(jiàn)表 1），調(diào) pH至 7.4，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 病原接種與培養(yǎng)

參考李曉云等的方法將豬的染蟲(chóng)紅細(xì)胞用含不同濃度藥物培養(yǎng)液替代PPLO-S-BS進(jìn)行培養(yǎng)，每種藥物的每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)重復(fù)，每24h用含相應(yīng)藥物的培養(yǎng)液更換培養(yǎng)孔中1/2體積的上清部分培養(yǎng)液。

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1.4 結(jié)果判定

培養(yǎng)開(kāi)始后觀察紅細(xì)胞和蟲(chóng)體的變化，統(tǒng)計(jì)紅細(xì)胞M.suis染蟲(chóng)率（PPE）、染蟲(chóng)強(qiáng)度、蟲(chóng)體顆粒大小、活力，染蟲(chóng)率統(tǒng)計(jì)方法是于400倍倒置顯微鏡下，分別從3個(gè)不同的視野直接計(jì)數(shù)200個(gè)紅細(xì)胞，統(tǒng)計(jì)平均染蟲(chóng)率，以紅細(xì)胞上觀察到1個(gè)以上的蟲(chóng)體寄生即判為陽(yáng)性。試驗(yàn)結(jié)果用STATISTICA軟件進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 藥物作用對(duì)豬紅細(xì)胞染蟲(chóng)率、染蟲(chóng)強(qiáng)度的影響

藥物作用之前紅細(xì)胞染蟲(chóng)率達(dá)86.7%，紅細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，呈棘球狀或鋸齒狀。加入藥物后，紅細(xì)胞染蟲(chóng)率變化見(jiàn)表1。強(qiáng)力霉素（≥100μg/mL）、土霉素（≥1000μg/mL）作用后，PPE 與對(duì)照差異顯著（p＜0.05）；土霉素（≤100μg/mL）、各濃度的酒石酸泰樂(lè)菌素、氟苯尼考、新霉素、慶大霉素、鏈霉素、青霉素作用后M.suis PPE與空白對(duì)照差異不顯著。

對(duì)染蟲(chóng)強(qiáng)度的影響：藥物作用之前單個(gè)紅細(xì)胞可見(jiàn)的染蟲(chóng)數(shù)量平均達(dá)5～10個(gè)以上，強(qiáng)力霉素、土霉素（≥100μg/mL）作用后紅細(xì)胞上可見(jiàn)蟲(chóng)體的數(shù)量減少，平均只有0～3個(gè)，紅細(xì)胞形態(tài)恢復(fù)圓形；其他幾種抗生素對(duì)豬霉形體染蟲(chóng)強(qiáng)度無(wú)明顯影響。

2.2 有效藥物對(duì)M.suis的殺滅作用

上述明顯影響M.suis染蟲(chóng)率的藥物作用于染蟲(chóng)紅細(xì)胞后，蟲(chóng)體首先從紅細(xì)胞上游離至培養(yǎng)液中，作升降、扭轉(zhuǎn)、翻滾、伸屈、搖擺、轉(zhuǎn)圈等多種形式的運(yùn)動(dòng)，后運(yùn)動(dòng)減弱，蟲(chóng)體消失不見(jiàn)。紅細(xì)胞原有的振顫、擺動(dòng)、小范圍滑行、滾轉(zhuǎn)等運(yùn)動(dòng)特點(diǎn)也隨蟲(chóng)體數(shù)量的減少減弱直至靜止不動(dòng)。

3 討論

由于M.suis的體外培養(yǎng)大量增殖難題尚未破解，用傳統(tǒng)的藥敏試驗(yàn)方法檢測(cè)其對(duì)藥物的敏感性受到限制。本研究參考李曉云等建立的M.suis體外培養(yǎng)方法，將受試藥物加入培養(yǎng)體系中，可隨時(shí)于鏡下直接觀察蟲(chóng)體及染蟲(chóng)紅細(xì)胞的變化。這一方法與鄭海紅等、張守法等的方法相比，具有結(jié)果更直觀，統(tǒng)計(jì)更接近培養(yǎng)的自然狀態(tài)的優(yōu)點(diǎn)。

對(duì)M.suis有明顯殺滅效果的強(qiáng)力霉素、土霉素等有效濃度較高，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于霉形體屬的有效藥物抑制濃度，臨床上也報(bào)道藥物難以消除感染M.suis動(dòng)物的帶蟲(chóng)狀態(tài)，據(jù)此我們推測(cè)M.suis的抗藥能力比較強(qiáng)，這可能是臨床上難以消除M.suis的原因之一。

部分藥物或某些藥物的低濃度作用后，PPE不降反升（差異不顯著），分析其原因，一方面是藥物對(duì)M.suis無(wú)抑制作用，另一方面培養(yǎng)過(guò)程中蟲(chóng)體可能有少量的增殖或部轉(zhuǎn)移到未感染的紅細(xì)胞上。

臨床上常用的青霉素、鏈霉素、氟苯尼考、新霉素、慶大霉素等抗生素，以及對(duì)大部分霉形體屬有抑制作用的泰樂(lè)菌素，在本試驗(yàn)中即時(shí)使用較高濃度也未觀察到其對(duì)M.suis的殺滅作用，因此，臨床上發(fā)生附紅細(xì)胞體病后應(yīng)慎用抗生素。更多有效藥物的篩選有待進(jìn)一步研究。

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