60 Co-γ射線輻射對(duì)家蠶抗菌肽誘導(dǎo)效應(yīng)研究

代君君 范 濤 周業(yè)奉 魏國清 范后文 肖林珍 吳傳華 王儲(chǔ)炎 田善富

(1安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶桑研究所,安徽合肥 230061;2合肥永豐畜禽有限公司,安徽合肥 231200;3安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,安徽合肥 230036)

近年來,隨著青霉素等傳統(tǒng)抗生素長(zhǎng)期、廣泛地使用,許多細(xì)菌都產(chǎn)生了明顯的抗藥性,已對(duì)人們的健康產(chǎn)生了嚴(yán)重的威脅,尋找安全可靠的抗生素的替代品已成為一個(gè)熱點(diǎn)問題?？咕?antibacterial peptides)是生物體免疫防御系統(tǒng)產(chǎn)生的一類抵抗外源病原體的防御性多肽類活性物質(zhì),是生物體先天免疫的重要組成成分,在機(jī)體的先天非特異性免疫中起著非常重要的作用[1]。大量研究證明,與普通抗生素相比,抗菌肽的“抗菌譜”更廣,抗菌肽不但能殺死抗藥病原菌,在使用過程中也不易使病原菌產(chǎn)生耐藥性突變,而且它能抑制細(xì)菌產(chǎn)物誘導(dǎo)產(chǎn)生對(duì)人體有害的細(xì)胞因子[2],因而極有希望開發(fā)成為一種新型的廣譜高效抗菌藥物。

根據(jù)氨基酸的組成和結(jié)構(gòu)特征,抗菌肽可分為天蠶素(cecropins)、防御素(defensins)、蛙皮素(magainins)和蜂毒素(melittins)[3]等類型。由于抗菌肽具有無毒副作用、無殘留、無細(xì)菌耐藥性、熱穩(wěn)定、水溶性好、廣譜殺菌等優(yōu)點(diǎn),且對(duì)畜禽具有促生長(zhǎng)、保健和治療疾病的功能[4];因此,在農(nóng)業(yè)、畜牧業(yè)等領(lǐng)域中有著廣闊的應(yīng)用前景。

家蠶抗菌肽是其血淋巴中產(chǎn)生的具有抗菌活性的小分子多肽,在家蠶的天然免疫中起著至關(guān)重要的作用。由于在生物體內(nèi)天然抗菌肽含量很少,化學(xué)合成抗菌肽的成本太高,且抗菌肽的分子量較小,難以分離純化,價(jià)格昂貴,嚴(yán)重制約了抗菌肽在生產(chǎn)上的應(yīng)用;故探索如何獲得大量天然的抗菌肽,具有非常重要的意義。本研究采用不同劑量的60Co-γ射線對(duì)幾個(gè)家蠶品種進(jìn)行輻射處理,測(cè)定其抗菌肽的抑菌效果,研究結(jié)果對(duì)開發(fā)抗菌肽提供了一定的理論依據(jù),也為家蠶的綜合利用探索一條新的途徑。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試家蠶品種：871×872、872×871、菁松×皓月、皓月×菁松,由安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶桑研究所提供;供試菌種：枯草桿菌,由安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)微生物教研室提供;主要試劑：瓊脂、牛肉膏、蛋白胨、LB液體培養(yǎng)基等,購自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司,其它試劑均為國產(chǎn)分析純。主要儀器：L YO-2真空冷凍干燥機(jī);G L-2L M型高速冷凍離心機(jī);HP x-96MB E數(shù)顯電熱培養(yǎng)箱;MLS-375三洋高壓滅菌鍋;PHS-4CT型精密酸度計(jì)等。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 抗菌肽的誘導(dǎo)與提取 參照文獻(xiàn)[5]的方法,將5齡第2天的871×872、872×871、皓月×菁松、菁松×皓月的家蠶,分別用60Co-γ射線輻射,輻射劑量為20 Gy(輻射8 min)、50 Gy(輻射20 min)、100 Gy(輻射40 min),以不作輻射處理的為對(duì)照區(qū);每個(gè)品種、每個(gè)處理20頭蠶,4個(gè)重復(fù),共計(jì)48個(gè)小區(qū)。輻射處理后的蠶正常飼養(yǎng)24 h之后,放到-30 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?0Co-γ射線輻射在安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所完成。

采用乙酸浸提法[6]提取不同蠶品種的抗菌肽,取用經(jīng)過輻射處理后的不同處理的5 齡家蠶,分別稱量、剪碎并用組織搗碎機(jī)搗碎、勻漿,然后用等體積的5%乙酸混合,在4 ℃條件下攪拌過夜后隔水煮沸15 min,迅速冷卻?；旌衔镌? ℃、8 000 r/min的條件下離心30 min后,取上清液放入冰箱在4 ℃條件下保存;沉淀物用等體積的5%乙酸混合,再次在4 ℃條件下攪拌、浸提過夜,重復(fù)上述離心過程,取上清液,合并2次上清液,將pH值調(diào)整為7.0,再次離心,棄沉淀,將上清液用液氮快速冷凍后,在真空壓力15 Pa、-65 ℃條件下進(jìn)行冷凍干燥,收集凍干粉即為家蠶抗菌肽類物質(zhì)的粗制品。

1.2.2 家蠶抗菌肽類物質(zhì)抑菌活性的測(cè)定 按普通培養(yǎng)基的配制方法配制培養(yǎng)基[7],放入高壓滅菌鍋中高壓滅菌后備用。將枯草桿菌在普通固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)24 h后,取生長(zhǎng)良好的菌落放在液體培養(yǎng)基內(nèi),在37 ℃搖床上培養(yǎng)24 h,備用。另取5 mL經(jīng)過滅菌的普通固體培養(yǎng)基于9 cm培養(yǎng)皿中,冷卻到45 ℃左右溫度后,加上述枯草桿菌的菌液1 mL,迅速搖勻,待冷卻凝固后再進(jìn)行下一步操作。

抑菌活性的測(cè)定參照葛兆宏[8]的紙片擴(kuò)散法進(jìn)行,取直徑為1 cm滅菌后的圓形濾紙片,每片濾紙均勻地涂上不同品種、不同處理的家蠶抗菌肽類物質(zhì)的上清液70 μL,然后均勻地排列在裝有固體培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中。移至培養(yǎng)箱中,37 ℃培養(yǎng)24 h,觀察抑菌圈,測(cè)定抑菌圈的大小,用抑菌圈的直徑來反應(yīng)抗菌肽活性的高低。

1.3 數(shù)據(jù)處理

分別記錄4 個(gè)家蠶品種、3 種不同60Co-γ射線輻射處理對(duì)枯草桿菌抑菌圈的直徑,并對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析,說明不同處理、不同品種家蠶產(chǎn)生的抗菌肽,對(duì)枯草桿菌的抑菌效果和對(duì)家蠶抗菌肽抑菌能力的影響。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同輻射劑量不同家蠶品種的抗菌肽對(duì)枯草桿菌的抑制作用

4個(gè)不同家蠶品種的5齡蠶經(jīng)過不同輻射處理產(chǎn)生的抗菌肽,對(duì)枯草桿菌都有明顯的抑制作用。從抑菌圈直徑大小來看,不同家蠶品種的5齡蠶經(jīng)過不同劑量60Co-γ射線輻射處理后產(chǎn)生的抗菌肽,對(duì)枯草桿菌的抑菌效果都有不同程度的增加,采用20 Gy的60Co-γ射線輻射處理的抗菌肽,對(duì)枯草桿菌的抑菌效果最好(圖1),其次是采用50 Gy和100 Gy的60Co-γ射線輻射后產(chǎn)生的抗菌肽對(duì)枯草桿菌的枊菌效果。從采用20 Gy的60Co-γ射線輻射不同家蠶品種產(chǎn)生的抗菌肽對(duì)枯草的抑菌效果來看,872×871抗菌肽的抑菌效果最好,對(duì)枯草桿菌的抑菌圈直徑為3.00 cm,比對(duì)照的2.10 cm提高了42.9%;871×872抗菌肽的抑菌效果其次,對(duì)枯草桿菌的抑菌圈直徑為2.57 cm,比對(duì)照的1.97 cm提高了30.5%;皓月×菁松與菁松×皓月抗菌肽的抑菌圈直徑相同,均為 2.20 cm,分別比對(duì)照提高了22.2%、27.2%(表1)。

表1 不同輻射劑量不同家蠶品種的抗菌肽對(duì)枯草桿菌的抑菌圈直徑

采用不同劑量的60Co-γ射線對(duì)家蠶進(jìn)行輻射處理后,家蠶抗菌肽的抑菌圈直徑比對(duì)照組的抑菌圈直徑顯著增大,這表明60Co-γ射線輻射家蠶后其抗菌肽的抑菌活性增強(qiáng),但不同品種之間的抑菌圈大小有所不同,不同輻射劑量處理對(duì)家蠶抗菌肽的抑菌活性也各不相同;但其抑菌活性表現(xiàn)出相同的規(guī)律,即在不同品種之間的抑菌活性為872×871＞871×872＞菁松×皓月＞皓月×菁松;在不同劑量之間是低劑量60Co-γ射線輻射的抗菌肽抑菌效果最高,隨著輻射劑量的增加,抗菌肽的抑菌效果有減弱的傾向。

圖1 20 Gy輻射劑量處理不同家蠶品種產(chǎn)生的抗菌肽對(duì)枯草桿菌的抑菌效果

2.2 不同品種、不同處理對(duì)家蠶抗菌肽的抑菌效果

為進(jìn)一步說明品種、輻射處理對(duì)家蠶抗菌肽抑菌效果的影響,我們對(duì)表1 不同輻射劑量不同蠶品種的抗菌肽對(duì)枯草桿菌的抑菌圈直徑進(jìn)行方差分析和F測(cè)驗(yàn)(表2),從表2可以看出,不同品種F值20.12＞F0.01(3,9)=6.99,所以P＜0.01,這說明品種間的抑菌差異達(dá)到極顯著水平;不同輻照處理F值21.33＞F0.01(3,9)=6.99,所以P＜0.01,這說明不同輻照處理間的抑菌差異也達(dá)到了極顯著水平。

表2 不同輻射劑量不同蠶品種的抑菌圈直徑的方差分析

3 討論

近年來,藥物的濫用、殘留和細(xì)菌耐藥性等問題已經(jīng)嚴(yán)重地威脅著人們的健康;因此,尋找安全高效全新類型的抗菌藥物是解決上述問題的一條有效途徑?？咕囊蚩咕钚愿摺⒖咕V廣、種類多、可供選擇的范圍廣,靶菌株不易產(chǎn)生抗性突變等原因,而被認(rèn)為有廣闊的應(yīng)用前景。雖然可從機(jī)體內(nèi)提取抗菌肽,但含量極微,給其應(yīng)用帶來了極大的困難。為了能降低抗菌肽的生產(chǎn)成本,人們?cè)噲D通過基因工程手段來大規(guī)模生產(chǎn)抗菌肽,現(xiàn)已人工設(shè)計(jì)合成了抗菌肽D、BD及AD基因,并且成功地將其導(dǎo)入釀酒酵母及畢赤酵母中進(jìn)行表達(dá)[9-12]但工藝復(fù)雜,表達(dá)成本高,表達(dá)量有限,這也制約著抗菌肽的進(jìn)一步開發(fā)與應(yīng)用。本研究結(jié)果表明60Co-γ射線輻射可以有效增強(qiáng)家蠶抗菌肽的抑菌活性,這為開發(fā)和利用家蠶抗菌肽提供了基礎(chǔ)。

為探索抗菌肽在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用,人們發(fā)現(xiàn)通過添食抗菌肽可以提高畜禽的抗病能力和促進(jìn)畜禽的生長(zhǎng)發(fā)育[13-14],但是由于抗菌肽分子量小、分離提取困難、價(jià)格昂貴等原因,嚴(yán)重制約著抗菌肽在生產(chǎn)上的應(yīng)用。王海富等[15]嘗試用人工飼養(yǎng)的蠅蛆養(yǎng)雞,蛋黃大,膽固醇含量低且雞極少生病,經(jīng)濟(jì)效益好;這為開展利用昆蟲的天然抗菌肽提供了有效途徑。家蠶是世界上飼養(yǎng)量最大的昆蟲,其飼養(yǎng)技術(shù)成熟,可以大規(guī)模生產(chǎn),家蠶抗菌肽研究也比較深入。因此,家蠶是新一代理想的高效抗菌劑載體。如果將家蠶直接作為飼料添加劑,既增加了飼料的營養(yǎng)成分,又省去了提取抗菌肽的中間環(huán)節(jié),必將降低生產(chǎn)成本,為開展家蠶的綜合利用提供了一條新的途徑。

本研究表明,利用適量的60Co-γ射線輻射家蠶可以有效提高家蠶抗菌肽的抑菌活性,在本研究中只采用了生產(chǎn)上的2 對(duì)品種和60Co-γ射線進(jìn)行輻射處理,僅測(cè)定其抑菌活性,沒有對(duì)抗菌肽的類型進(jìn)行鑒定;所以,不同品種、不同誘導(dǎo)源、不同誘導(dǎo)劑量所誘導(dǎo)的抗菌物質(zhì)的種類和數(shù)量是否有差異,還值得進(jìn)一步深入研究。

[1]Boman H G.Antibacterial peptides：Key components needed in im-munity[J].Cell,1991,65：205-207.

[2]趙超.抗菌肽的研究現(xiàn)狀[J].科學(xué)之友,2008,27(1)：47-50.

[3]盧曉風(fēng),楊星勇,程驚秋.昆蟲抗菌肽及其研究進(jìn)展[J].藥學(xué)學(xué)報(bào),1999,34(2)：156-160.

[4]羅剛,魏泓.哺乳動(dòng)物抗菌肽研究進(jìn)展[J].四川動(dòng)物,2002,21(4)：255-257.

[5]徐進(jìn)署,張雙全.昆蟲抗菌肽對(duì)病原微生物作用的研究進(jìn)展[J].昆蟲學(xué)報(bào),2002,45(5)：673-678.

[6]朱祥瑞,陳玉銀,潘佩飛,等.蠶卵抗菌物質(zhì)的誘導(dǎo)及其蟻蠶的動(dòng)物試驗(yàn)[J].浙江農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),1999,25(2)：183-186.

[7]范志勇,周定剛,吳明夏,等.豬小腸抗菌肽的抑菌作用研究[J].家畜生態(tài)學(xué)報(bào),2006,27(6)：99-101.

[8]葛兆宏.動(dòng)物微生物學(xué)[M].北京：中國農(nóng)業(yè)出版社,2001：165-167.

[9]王新,陳海旭.重組刺桐胰蛋白酶抑制劑a在大腸桿菌中的表達(dá)和純化[J].中國生物化學(xué)與分子生物學(xué)報(bào),2002,18(3)：22-27.

[10]黃亞東,鄭青,李校堃,等.天蠶抗菌肽AD基因在AcNPV載體系統(tǒng)中的表達(dá)研究[J].中國抗生素雜志,2003,(5)：11-13.

[11]韓萬江,夏天輝.ApiIa抗菌肽基因的化學(xué)合成,克隆及其在酵母中的表達(dá)[J].復(fù)旦學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),1998,(2)：13-15.

[12]沈俊卿,田昱.抗菌肽ABP3基因的克隆及其在Pichia pastoris中的表達(dá)[J].生物工程學(xué)報(bào),1999,(4)：20-23.

[13]黃永彤,黃自然,黃建清,等.抗菌肽與抗生素飼喂肉雞的效果比較[J].廣東飼料,2004,13(2)：24-26.

[14]何丹林,溫劉發(fā),鄧春柳,等.蠶抗菌肽AD-酵母制劑對(duì)粵黃雞腸道消化酶和飼料品質(zhì)的影響[J].中國家禽,2004,26(7)：9-11.

[15]王海富.蠅蛆養(yǎng)雞養(yǎng)豬創(chuàng)特色[J].山西農(nóng)業(yè)(畜牧獸醫(yī)版),2007,(12)：40-41.