豬繁殖與呼吸綜合征診斷方法研究進展

趙澤坤,王 嬌,王金鳳,張嶺嶺,孫繼國

(河北農(nóng)業(yè)大學動物科技學院,河北保定071001)

豬繁殖與呼吸綜合征(porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS),又稱“豬藍耳病”,主要以引起母豬的繁殖障礙以及呼吸道的癥狀為特征,由于PRRSV與其他引起豬繁殖障礙的疾病等引起的臨床癥狀相似難以區(qū)分,并且由于其他細菌性疾病和病毒性疾病的繼發(fā)感染,使得臨床診斷更加困難,因此很難對該病做出準確診斷,必須進行病毒分離、免疫學檢測以及運用分子生物學技術綜合診斷才能確診。

1 病毒分離

病毒分離是PRRS最為確切的實驗室診斷方法。病毒分離最好采用死胎或弱仔豬的肺、腦、脾、血漿、血清等組織勻漿的混合物,經(jīng)處理后接種于適當?shù)募毎囵B(yǎng)物。目前用于分離PRRSV的細胞有以下兒種:豬原代PAM,CL-2621,細胞克隆株Marc-145細胞最后又從Marc-145中克隆出更敏感的HS2H細胞用于PRRSV的分離。

PRRS發(fā)病急性期出現(xiàn)病毒血癥,因此,急性期采樣時,分離成功率較高。另外,與成年豬相比,仔豬及死胎更適宜于采樣分離。但不同分離株在細胞培養(yǎng)上生長繁殖的情況各不相同,有些毒株在每一代細胞培養(yǎng)3 d～4 d即可出現(xiàn)CPE,但有些毒株則需在第3代或4代才出現(xiàn)CPE,有些分離株在敏感細胞上并不出現(xiàn)細胞病變。因此,在進行病毒分離的同時,還應結合相應的IFA和IPMA等方法進行鑒定。另外,還可用PCR法增殖病毒抗原,作遺傳基因鑒定,從而使結果更為可靠[1]。

2 抗原檢測

對PRRSV抗原的檢測一般建立在特異性單抗的基礎上,用全病毒抗原或多肽表達產(chǎn)物作為免疫原,已分別獲得PRRSV N,M,GP5,GP4,GP3蛋白的特異性單抗,其中N蛋白的免疫原性最強,用全病毒免疫所獲得的單抗多半是針對N蛋白上的抗原表位。這些單抗中有些是針對美洲型和歐洲型毒株上共同的保守性抗原位點,有些僅與美洲型或歐洲型毒株中的一型發(fā)生反應,合理地利用這些單抗進行檢測,可以同時檢出美洲型和歐洲型PRRSV,也可區(qū)分其血清型。檢測抗原的方法主要包括免疫熒光染色法、免疫過氧化物酶染色法,以及免疫膠體金技術。由于豬感染PRRSV后血清抗體可長時間持續(xù)存在,且抗原檢測時病料組織的處理較為繁瑣,因此,血清學試驗檢測抗體更適宜于PRRS的疾病監(jiān)測和診斷。

3 血清學方法

PRRS診斷的血清學方法也是目前診斷該病最為廣泛的方法。目前可用于檢測PRRS的血清學方法主要有間接免疫熒光實驗(IFA)、免疫過氧化物酶單層試驗(IPMA)、血清中和實驗(SN)、酶聯(lián)免疫吸附試驗((ELISA)等四種。

3.1 免疫過氧化物酶細胞單層試驗(IPMA)

IPMA具有較好的特異性和敏感性,是歐洲國家廣泛使用的血清學診斷方法,在美洲和亞洲國家也較為常用?？捎帽驹囼灆z測病豬和康復后豬的雙份血清中的LV抗體。這種方法特異性強,可測出感染后1周～2周至12個月的抗體,抗體效價低于100為陰性。試驗主要在PAM,Marc-145,CL-2621細胞來進行,此方法特異性與敏感性較好,可以用于PRRSV的抗原檢測、病毒的鑒定、血清抗體的檢測。該法能在感染后6日血清中檢測到抗體,但本方法需要專門的實驗設施,并且容易出現(xiàn)假陽性,主觀性較強。

3.2 間接熒光抗體試驗(IFA)

IFA是美國、加拿人、日本等國廣為應用的血清學檢測方法,敏感性和特異性與IPMA相當,抗原制備也與IPMA法相同。IFA可檢測出感染后2 d～28 d的IgM抗體,血清抗體效價低于1∶20者為陰性。Joo H S等[2]用間接熒光抗體試驗檢測了接種不同PRRSV毒株豬的IgG和IgM抗體反應,發(fā)現(xiàn)攜帶有IgM抗體的豬此前不久很可能受到PRRSV的感染。我國于1996年由哈爾濱獸醫(yī)研究所建立了1FA檢測方法。尹訓南等[3]應用IFA技術對人工感染PRRSV的3日齡～30日齡健康和/或SPF仔豬體內病毒抗原或核酸的分布進行研究,從臟器的血管內皮細胞及血管內和巨噬細胞內檢出了病毒抗原和核酸,此法的特異性與敏感性較好。但是,同IPMA一樣,這兩種方法的結果判斷帶有一定的主觀性,且不適于大規(guī)模臨床樣品的檢測。

3.3 酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)

ELISA適宜于大規(guī)模檢測,方便易行,操作過程及結果判斷能夠標準化,且具有高度的特異性和敏感性,目前許多國家已把ELISA作為監(jiān)測診斷的常規(guī)手段。另外,血清中PRRSV的ELISA抗體出現(xiàn)時間與IPMA和IFA抗體相當,但血清中PRRSV的ELISA抗體的持續(xù)時間明顯長于IPMA和IFA抗體的持續(xù)時間。ELISA可測定感染后2周病毒抗體,當OD值大于或等于0.4時可判為陽性。

ELISA方法敏感、特異,比IPMA方法能更早的檢測出抗體。間接ELISA主要用于檢測血清中抗體,如PRRSV抗體,也可檢測抗原。Srensen K等[4]分別用3種方法(阻斷ELISA、間接ELISA,IPMA)檢測PRRSV抗體,結果發(fā)現(xiàn)阻斷ELISA的敏感性和特異性最高,與另外兩種方法相比,它成本較低,更易于大面積推廣。競爭性ELISA可檢測抗體,Dea S等[5]成功地用該法檢測出了PRRSV核衣殼蛋白的抗體。王剛等[6]用差速離心法提純PRRSV利用NC膜作為載體,成功地建立了檢測PRRSV抗體的Dot-ELISA。

用于ELISA的抗原有兩種,一種是從細胞培養(yǎng)物中純化的全病毒抗原,一種是重組的PRRSV核衣殼蛋白。因為Marc-145細胞抗原成分容易引起非特異性反應,所以待檢的血清樣品必須同時對正常的細胞抗原進行平行檢測作為對照。

3.4 血清中和試驗(SN)

本法主要用于檢測PRRSV抗體,使用MARC-145細胞在96孔微量板上進行。傳統(tǒng)的NT試驗不能檢出急性感染期的抗體,并且需用雙份血清。Yoon和Takikawa等在血清和病毒混合液中加入補體,提高了反應的敏感性,可在PRRSV感染早期作出診斷[7]這種改良后的方法最早在接種后8 d即能檢出NT抗體。接種11 d～21 d和41 d～45 d抗體效價較高。

4 分子生物學診斷

與血清學診斷方法相比,分子生物學診斷方法具有更高的特異性和敏感性。其方法主要包括核酸探針原位雜交技術(ISH)和RT-PCR技術。

4.1 原位雜交技術(ISH)

進行原位雜交的cDNA探針主要是針對PRRSV的ORF7設計的。ISH用于PRRSV的檢測,其敏感性高于免疫組化法和免疫膠體金技術,而且檢出的持續(xù)時間更長,因為PRRSV RNA在組織中的存在時間較其抗原的表達時間長。另外,根據(jù)美洲型和歐洲型PRRSV的核酸序列設計合成不同的探針可區(qū)別不同基因型PRRSV的感染,而將兩種探針棍合后進行ISH,則兩種基因型的感染均可檢出。該方法可以在肺、淋巴結、肺泡巨噬細胞等組織感染細胞內檢測到PRRSV的RNA。

4.2 RT-PCR技術

RT-PCR法PCR為80年代中期發(fā)展的一種針對微生物核苷酸新的特異性診斷技術,因具有較高的特異性和敏感性,己廣泛應用病毒病診斷。RTPCR法不僅能診斷PRRSV,而且能進行不同分離株的基因鑒定。據(jù)報道,RT-PCR技術能檢測出10—5TCID50病毒,故在診斷PRRS的工作中受到越來越多人歡迎。國外Christoph E等[8]建立了TaqMan RT-PCR法,對美洲毒株和歐洲毒株混合感染的群豬進行鑒別診斷。Wesley R D等[9]對ORF5的RT-PCR產(chǎn)物進行RFLP分析時可以區(qū)分疫苗株和野毒株。

針對2006年以來在我國發(fā)生的高致病性豬藍耳病,田克恭等首先建立了專門針對H-PRRSV的特異性RT-PCR方法。該方法具有良好的特異性,敏感性可達到4TCID50,該方法已申請專利(申請?zhí)?200710086548.2)。目前已有各種不同的針對高致病性PRRSV的RT-PCR方法,隨著技術的發(fā)展,新建立的RT-PCR、多重PCR、RTPCR-RFLP對診斷PRRSV的特異性更強,敏感性更高。不僅可用于檢測各種臨床樣品,還可以鑒別不同基因型的毒株,區(qū)分疫苗株和野毒株。因此,RT-PCR方法無疑是一種快速、準確、靈敏的診斷方法。

5 小結

今年來,PRRS對養(yǎng)豬業(yè)的危害越來越嚴重,由于PRRSV不同分離株尤其是不同基因型(群)分離株在毒力、生物學特性、抗原性和遺傳特性上存在一定差異,利用單一PRRSV毒株制備的疫苗并不能完全保護免疫豬免受異源毒株的感染,因此,對PRRSV的早期的診斷至關重要。

雖然現(xiàn)在已有各種不同的檢測技術,但是由于在臨床應用上有著各種缺陷和局限性,并且隨著時代的進步,對PRRSV診斷方法的先進性、靈敏度、特異性有更高的要求,建立特異、敏感、簡便、快速的診斷檢測技術仍是PRRSV研究的一個重要方向。

[1] Rossow K D,Bautista E M,Goyal S M,et al.Experimental porcine reproductive and respiratory syndrome virus infection in one-、four-、and 10-week-old pigs[J].J Vet Diagm Invest,1994,6(1):3-12.

[2] Joo H S,Park B K,Dee S A.Indirect fluorescent antibody response of pig infected with porcine reproductive and respirtory syndrome virus[J].Vetrinary Microbiology,1997,55(124):303-307.

[3] 尹訓南,郭寶清,豬生殖呼吸道綜合征病毒抗原在仔豬體內定位的研究[J].中國畜禽傳染病,1997(5):57-49.

[4] Srensen K,Btner A,Smedegaard J,et al.Evalution of a blocking ElISA for screening of antibodies againstporcine reproductive and respirtory syndrome(PRRS)virus[J].Veterinary Microbiology,1996,56(122):1-8.

[5] Dea S,Wilson H,Therrien M,et al.Detection of antibodies to the nucleocapsid protein of PRRS virus by a competitive ELISA[J].Adv Exp Med Bio,2001,494:401-405.

[6] 王 剛,張鶴曉,甘孟侯,等.IPMA檢測豬繁殖與呼吸綜合征抗體的研究[J].中國獸醫(yī)雜志,1996,22(10):3-5.

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[9] Wesley R D,Mengeling W L,Lager K M,et al.Differentiation of a porcine reproductive and respiratory syndrome virus vaccine strain from north American field strains by restriction fragment length polmorphism analysis of ORF5[J].Vet Diagn Invest,1998,10:104-144.