口蹄疫疫苗的研究歷程

劉亞彬,閔成軍

(江蘇雨潤(rùn)食品產(chǎn)業(yè)集團(tuán)有限公司,江蘇南京 210041)

口蹄疫疫苗的研究歷程

劉亞彬,閔成軍*

(江蘇雨潤(rùn)食品產(chǎn)業(yè)集團(tuán)有限公司,江蘇南京 210041)

口蹄疫(FMD)是世界性重大動(dòng)物疫病,接種疫苗是特異性預(yù)防口蹄疫的有效手段,安全有效的疫苗是成功預(yù)防、控制乃至最終消滅口蹄疫的先決條件,在口蹄疫的防控中,滅活疫苗功不可沒(méi),但同時(shí)也存在許多隱患。隨著分子生物學(xué)、遺傳學(xué)及免疫學(xué)等學(xué)科的迅猛發(fā)展,口蹄疫疫苗的研究也取得了較快的進(jìn)展,各種基因工程疫苗如亞單位疫苗、合成肽疫苗、核酸疫苗、可飼疫苗、多表位疫苗等不斷涌現(xiàn),為口蹄疫的防控帶來(lái)了新的希望。

口蹄疫;疫苗;防控

口蹄疫(Food-and-mouth disease,FMD)是由口蹄疫病毒(FMDV)所引起的偶蹄家畜的急性、熱性、高度接觸性傳染病,羊、豬和牛都可患此病,有時(shí)還可以傳染給人,其特征是在口腔黏膜和鼻、蹄、乳頭等部位皮膚形成水泡和爛斑。本病傳播迅速,危害性強(qiáng),被世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(OIE)列為國(guó)際動(dòng)物貿(mào)易間必須檢疫的A類動(dòng)物傳染病,我國(guó)農(nóng)業(yè)部也將其劃定為一類動(dòng)物傳染病,本病也是最具政治經(jīng)濟(jì)色彩的烈性動(dòng)物疫病。因此,各國(guó)都在致力于控制和消滅口蹄疫的工作,而對(duì)大多數(shù)國(guó)家來(lái)說(shuō),疫苗免疫是防控本病的關(guān)鍵措施。近一個(gè)世紀(jì)以來(lái),許多國(guó)家為了預(yù)防和控制口蹄疫的發(fā)生和流行,對(duì)疫苗的研究一直沒(méi)有間斷過(guò)。

1 由動(dòng)物病損組織制成的疫苗

強(qiáng)毒接種、強(qiáng)毒與免疫血清混合接種易感動(dòng)物,或采集病變組織,用A l(OH)3吸附、甲醛滅活病毒的方法制成的疫苗。這類疫苗在20世紀(jì)20年代見(jiàn)于歐洲。由于制造成本高,在生產(chǎn)中易散播病毒,疫苗中殘存的活病毒難以用甲醛滅活,且免疫力有限,因而未能廣泛推廣應(yīng)用。

2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物疫苗

將口蹄疫病毒適應(yīng)于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物后,取含毒量高的動(dòng)物組織制備滅活疫苗;或經(jīng)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物連續(xù)傳代,培育成弱毒后制造疫苗。這種方法既可擴(kuò)大病毒的產(chǎn)量,又可降低本動(dòng)物增殖病毒造成的散毒;鼠苗兔苗、雞胚苗都屬此類。這類疫苗起始于20世紀(jì)40年代,在40年代～50年代的大規(guī)模預(yù)防接種中,不論在免疫效力還是經(jīng)濟(jì)方面都具有優(yōu)勢(shì)。但是,這類疫苗仍具有許多缺陷,弱毒疫苗存在遺傳性不確定,而且病毒對(duì)一種動(dòng)物的減毒并不能保證對(duì)其他動(dòng)物減毒,長(zhǎng)期使用可能會(huì)形成持續(xù)感染,長(zhǎng)時(shí)間培育的弱毒不適宜新疫區(qū)的動(dòng)物免疫。從20世紀(jì)70年代起,這類疫苗的研究和使用逐漸萎縮。

3 組織、細(xì)胞培養(yǎng)疫苗

20世紀(jì)20年代～30年代,口蹄疫病毒的組織培養(yǎng)研究盛行一時(shí),但是一直到抗生素有效控制細(xì)菌污染之后才有了突破。1947年Frenkel H S[1]首次用牛舌皮碎塊培養(yǎng)病毒獲得成功。不久,法國(guó)和阿根廷用Frenkel的方法生產(chǎn)甲醛滅活疫苗,隨后荷蘭等一些歐洲國(guó)家把Frenkel疫苗列為牛的計(jì)劃免疫用苗,改變了當(dāng)時(shí)歐洲口蹄疫的流行態(tài)勢(shì),疫情明顯下降。此苗雖能較好保持抗原性,且免疫后不出現(xiàn)變態(tài)反應(yīng),但還是不適宜大規(guī)模生產(chǎn)。

真正使用大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)的細(xì)胞是1962年英國(guó)Pirbright動(dòng)物病毒研究所的M owat G N等[2]培育的BHK細(xì)胞系,生產(chǎn)口蹄疫滅活疫苗,并很快商業(yè)化。此外,IBRS-2和倉(cāng)鼠胚胎傳代細(xì)胞(NIL-2,也叫IFFA 3)也用于生產(chǎn)病毒。

在滅活劑方面,最早采用甲醛溶液滅活口蹄疫病毒抗原氫氧化鋁膠混合物,但由于該混合物對(duì)細(xì)胞有毒性,且據(jù)報(bào)道,在歐美暴發(fā)的一些口蹄疫與滅活疫苗中殘留活病毒密切相關(guān)。后來(lái)采用作用于核酸的AEI作為滅活劑,疫苗抗原性保持較好,但毒性仍較大。后又用的BEI(binary ethylenim ine)作為滅活劑,這種滅活劑毒性小,易于控制。

4 基因工程疫苗

1975年Bachrach等從口蹄疫病毒分離衣殼蛋白VP1,配以不完全弗氏佐劑,制成了一種蛋白亞單位疫苗,有良好的免疫效果,為研制基因工程疫苗提供了依據(jù)。20世紀(jì)80年代以來(lái),國(guó)外許多實(shí)驗(yàn)室將DNA重組技術(shù)和口蹄疫病毒分子生物學(xué)的研究成果相結(jié)合,開(kāi)展了基因工程疫苗的研究。1981年K leid D G等[3]成功地進(jìn)行了口蹄疫病毒基因在原核細(xì)胞中的表達(dá),用其免疫牛和豬,能產(chǎn)生中和抗體。1985年Mckercher P D等[4]用大腸埃希氏菌表達(dá)的A 12病毒的VP1融合蛋白,制成油佐劑疫苗。1995年Mchenna等通過(guò)基因工程技術(shù)構(gòu)建了一株缺失RGD的口蹄疫病毒,并用此病毒接種牛使之產(chǎn)生抵抗強(qiáng)毒株攻擊的免疫力。2000年趙凱等報(bào)道應(yīng)用基因工程技術(shù),將在大腸埃希菌細(xì)胞中表達(dá)的融合蛋白注射豚鼠和豬后產(chǎn)生保護(hù)作用。

以后許多研究者用原核或真核的多種表達(dá)系統(tǒng)(包括植物)表達(dá)口蹄疫的單一或多種結(jié)構(gòu)蛋白,制成疫苗后免疫動(dòng)物,免疫效果各不相同,總的不及完整蛋白的滅活疫苗。

5 化學(xué)合成肽疫苗

口蹄疫病毒VPI被確認(rèn)為是主要免疫抗原蛋白,它帶有重要的中和位點(diǎn),根據(jù)VPI的基因序列,按推導(dǎo)的氨基酸序列化學(xué)合成VPI多膚,與能激發(fā)T細(xì)胞免疫的蛋白相連制成疫苗。Bitlle JL[5]首次根據(jù)O1型口蹄疫病毒、VP1基因氨基酸序列化學(xué)合成了20個(gè)氨基酸(140-160即B細(xì)胞抗原表位)的肽段,并與載體蛋白相藕聯(lián),接種豚鼠產(chǎn)生中和抗體并具有保護(hù)作用。1986年 Dimarchi R等[6]用VP1的2個(gè)免疫原區(qū)(141-158和200-210)的合成肽疫苗接種牛,大劑量(5 mg)免疫接種1次或小劑量(0.2mg)免疫接種2次,5/6獲得保護(hù)。另外免疫球蛋白是體液免疫反應(yīng)的主要成分,Chart EW等將O1K型FMDV的VP1(141-160位和200-213位氨基酸殘基)插入到豬IgG分子的一條重鏈恒定區(qū)scIgG)內(nèi),構(gòu)建了一新型嵌合體蛋白(F1-sc IgG),接種豬可產(chǎn)生特異性的中和抗體并誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞的增生,免疫乳鼠可耐受1 000 LD50的FMDV攻擊。這種嵌合蛋白的構(gòu)建將為研制FMD的新型疫苗提供新的思路。隨后的合成肽疫苗研制,大多通過(guò)增加T細(xì)胞和B細(xì)胞位點(diǎn)個(gè)數(shù)及其相鄰兩端的氨基酸位數(shù)來(lái)提高其免疫原性。在合成肽疫苗方面還有許多研究,但因這樣或那樣的問(wèn)題,一直沒(méi)有形成像滅活疫苗一樣廉價(jià)有效的產(chǎn)品。

6 核酸疫苗

化學(xué)合成肽疫苗都是用病毒蛋白或致弱病毒制成,而核酸疫苗(DNA疫苗)是用攜帶免疫原基因的核酸制成。早在20世紀(jì)70年代末,人們就證實(shí)了動(dòng)物體細(xì)胞具有攝取裸露DNA分子的能力。Ward G等構(gòu)建了在巨細(xì)胞病毒(CMV)早期啟動(dòng)子調(diào)控下,攜帶有 A 12 FMDV VP1的DNA疫苗。H uang H等利用豬IgG序列融合蛋白基因構(gòu)建的DNA疫苗,在不同的早晚期啟動(dòng)子控制下,接種豚鼠均可誘導(dǎo)中和抗體產(chǎn)生和脾細(xì)胞的增生,但未見(jiàn)到保護(hù)作用。后來(lái),Beard C等采用同樣的方法構(gòu)建了分別攜帶有完整的、突變的蛋白酶3C和突變的病毒與細(xì)胞結(jié)合位點(diǎn)的3個(gè)DNA質(zhì)粒,免疫豬后均可呈現(xiàn)出較強(qiáng)的抗病毒反應(yīng),但缺乏細(xì)胞結(jié)合位點(diǎn)的質(zhì)粒DNA無(wú)論是肌肉注射、鼻內(nèi)接種還是基因槍途徑接種,被免疫豬僅有部分保護(hù)。Wong H T等[7]利用VP1上第141位～160位和第200位213位氨基酸插入到鼠、豬的免疫球蛋白基因制備了DNA疫苗。實(shí)驗(yàn)證明后者效果較好,接種小鼠不僅引起強(qiáng)烈的T淋巴細(xì)胞反應(yīng)和很高的中和抗體水平,并可保護(hù)免疫豬抵抗10 FMDV的攻擊并得到百分之百的保護(hù)。以后,Li G J等人工合成60氨基酸的肽段即 141～160(20AA)-21-40(20AA)-141-160(AA),并將其插入豬IgG分子重鏈恒定區(qū)的3′端構(gòu)建DNA疫苗,肌肉注射豚鼠產(chǎn)生免疫反應(yīng),66%的免疫豬不受攻毒感染?？紤]到核酸疫苗的免疫效果,Cedillo Barron L等同時(shí)將P1-2A基因、3C基因和3D基因同時(shí)插入到真核細(xì)胞表達(dá)載體pcDNA 3.1中,用該DNA疫苗接種豬,盡管可形成FMDV空衣殼粒子、3D上CD8+T細(xì)胞抗原位點(diǎn)的存在以及FMDV特異性抗體產(chǎn)生,但免疫效果不令人滿意。

7 可飼疫苗

可飼疫苗是利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)將抗原基因?qū)胫仓曛?獲得表達(dá)抗原蛋白的植株,將該植株飼喂給動(dòng)物后,可刺激動(dòng)物胃腸道黏膜產(chǎn)生局部免疫應(yīng)答進(jìn)而獲得全身性的免疫保護(hù)。Curtiss首次提出用植物生產(chǎn)可飼疫苗的概念,并進(jìn)行了初步試驗(yàn)。1998年Carrillo等用表達(dá)了FMDV VP1基因的轉(zhuǎn)基因擬南芥葉浸提取物腹腔注射免疫小鼠,誘導(dǎo)特異性抗體產(chǎn)生,該抗體能與VP1蛋白的第135位～160位氨基酸殘基的多肽和完整的FMDV顆粒反應(yīng),所有免疫的小鼠均能抵抗FMDV強(qiáng)毒的攻擊。2001年Carrillo C等[8]在馬鈴薯中成功表達(dá)了VP1蛋白,動(dòng)物試驗(yàn)證明免疫動(dòng)物也能抵抗強(qiáng)毒的攻擊。He等構(gòu)建的表達(dá)載體pBIl2lCTBVP1經(jīng)農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化土豆,VP1和霍亂毒素B(CTB)的融合蛋白能在土豆中穩(wěn)定表達(dá),且具有一定的免疫原性。潘麗等已在番茄中成功表達(dá)了口蹄疫結(jié)構(gòu)蛋白P1-2A,3C和VP1,其葉片提取物接種豚鼠以后能抵抗活毒的攻擊。除此之外,研究者還在玉米、煙草、豇豆等植物中表達(dá)FMDV的抗原保護(hù)性基因,均已初見(jiàn)成效?？娠曇呙缡褂梅奖?、安全、為牛羊等草食動(dòng)物的口蹄疫防控帶來(lái)光明的前景。

雖然傳統(tǒng)的細(xì)胞培養(yǎng)來(lái)源的滅活苗很有效,但當(dāng)口蹄疫(FMD)在無(wú)病國(guó)家爆發(fā)時(shí),使用該疫苗仍然存在許多問(wèn)題。這主要包括很難區(qū)分滅活苗免疫動(dòng)物和感染動(dòng)物、在無(wú)FMD國(guó)家爆發(fā)該病時(shí)不能產(chǎn)生迅速的保護(hù)、接種這種疫苗不能阻斷形成病毒攜帶狀態(tài)、疫苗生產(chǎn)需要嚴(yán)格的病毒防范設(shè)施等。雖然這種嚴(yán)格的防范設(shè)施有著很好的安全記錄,但2007年8月在英國(guó)Pirbright具有高防范設(shè)施的實(shí)驗(yàn)室附近的農(nóng)場(chǎng)暴發(fā)了FMD,引起此次暴發(fā)的毒株來(lái)源于該區(qū)的疫苗制造廠和動(dòng)物衛(wèi)生研究所。這次FMD的暴發(fā)促使人們進(jìn)一步考察疫苗制造過(guò)程的安全性問(wèn)題。而在美國(guó)聯(lián)邦法只允許在梅島的實(shí)驗(yàn)室從事感染性口蹄疫病毒(FMDV)的實(shí)驗(yàn)研究,而且,美國(guó)沒(méi)有FMD的疫苗生產(chǎn)廠,主要是擔(dān)心病毒的逃逸。由于滅活疫苗存在諸多問(wèn)題,人們研制更加安全高效的FMD疫苗的步伐從未停止過(guò)。

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Progress of Foot-and-M outh Disease Vaccines

LIU Ya-bin,MIN Cheng-jun

(Yurun Group,N anjing,Jiangsu,210041,China)

Foot-and-mouth disease(FMD)is one of the most serious animal diseases,and vaccination is an effectivem ethod to guard against it.Safe and effective vaccine is the prerequisiteof successful prevention,controland eradication.Great contributions have beenmade by the inactivated vaccines but also there are m any hidden dangers.W ith the development of biotechnology,genetics and imm unology,rapid p rogress has also been made on foot-and-m outh disease vaccine research.Study and exploration on the subunit vaccines,synthetic peptide vaccines,DNA vaccines,transgenic p lant vaccines,m ult-iepitopes vaccines have been engaged in allover theworld.New hopes are brought by genic engineered vaccines.

Foot-and-mouth disease;vaccine;prevention and control

S852.659.6

A

1007-5038(2010)04-0272-03

2010-04-06

劉亞彬(1981-),男,安徽界首人,碩士,獸醫(yī)師,主要從事養(yǎng)殖管理工作。*通訊作者