牛傳染性鼻氣管炎診斷方法研究進(jìn)展*

徐曉琴,冷 雪,李真光,武 華

(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所人獸共患病研究室,吉林吉林 132109)

牛傳染性鼻氣管炎(Infectious bovine rhinotracheitis,IBR)是由牛傳染性鼻氣管炎病毒(Infectious bovine rhinotracheitis virus,IBRV)引起的牛的一種急性、熱性、接觸性傳染病。IBRV又稱牛皰疹病毒Ⅰ型、壞死性鼻炎病毒和傳染性膿皰外陰-陰道炎病毒。該病以高熱、呼吸困難、鼻炎、竇炎和上呼吸道炎癥為特征。還可引起生殖系統(tǒng)損害,出現(xiàn)流產(chǎn)和死胎以及發(fā)生腸炎和小牛腦炎等癥狀,有時(shí)也發(fā)生眼結(jié)膜炎和角膜炎[1]。繼發(fā)性的細(xì)菌感染能導(dǎo)致更嚴(yán)重的呼吸道疾病。

1955年在美國(guó)科羅拉多州首次發(fā)現(xiàn)以傳染性鼻氣管炎癥狀為特征的疾病,隨后出現(xiàn)在洛杉磯和加利福尼亞州等地,并被命名為IBR。Madin等在1956年首次從患牛中分離出病毒,隨后一些研究者相繼從病牛的結(jié)膜、外陰、大腦和流產(chǎn)胎兒分離出病毒。Huck于1964年確認(rèn)牛傳染性鼻氣管炎病毒為皰疹病毒。本病目前在世界范圍內(nèi)流行,對(duì)奶牛的產(chǎn)奶量、公牛的繁殖力及役用牛的使役力均有較大的影響,給全球的養(yǎng)牛業(yè)造成了極大的影響。

我國(guó)規(guī)定,進(jìn)出口牛及其肉制品必須檢測(cè)IBRV,使該病的診斷方法迅速發(fā)展起來。生產(chǎn)中對(duì)該病的診斷首先應(yīng)結(jié)合流行病學(xué)和臨床檢查做出初步診斷,然后根據(jù)實(shí)驗(yàn)室方法如血清學(xué)方法做出確切的診斷。

1 流行病學(xué)

牛是 IBRV自然感染的惟一宿主,試驗(yàn)證明IBRV可以通過很多途徑感染牛,以肉牛易感,奶牛次之,而其他動(dòng)物如綿羊、馬、豬、犬、豚鼠和小鼠等不易感。帶毒病畜是主要傳染源。牛感染本病后,在自然條件下可不定期的排出病毒,這與本病的流行傳播有重要的關(guān)系。

IBRV可通過空氣、媒介物,以及與病牛直接接觸而傳播,但主要為飛沫、交配和接觸傳播。吸血昆蟲也能傳播本病。本病在秋季和冬季較易流行,特別是舍飼的大群奶牛在過分擁擠、密切接觸的條件下更易迅速傳播。尤以20日齡～60日齡犢牛在寒冷季節(jié)最易感染發(fā)病。另外,應(yīng)激因素、社會(huì)因素、發(fā)情及分娩可能促使本病發(fā)作。

2 臨床癥狀

IBRV致病性最大的特點(diǎn)是組織嗜性寬廣,除經(jīng)常侵害呼吸系統(tǒng)外,還能侵害生殖系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)和眼結(jié)膜。另外,自然感染時(shí)發(fā)病程度的差異很大,最輕的是無臨床癥狀的隱性感染,只表現(xiàn)體溫輕度升高,重癥病牛則侵害整個(gè)鼻腔、咽喉和氣管,導(dǎo)致急性上呼吸道炎癥。臨床上可以分成以下5種類型[2]。

2.1 呼吸道型

本病的呼吸道型是最重要的一種類型,人工感染的潛伏期為2 d～3 d,自然感染的潛伏期較長(zhǎng),可達(dá)1周。病毒首先侵入上呼吸道黏膜,其次是消化道,引起急性卡他性炎癥,鼻分泌物由漿液性變?yōu)轲ひ盒?最終變?yōu)槟撔?并混有血液。臨床表現(xiàn)為發(fā)熱,病畜體溫達(dá)42℃,食欲減退,呼吸困難并伴隨鼻腔通道和氣管有黏膿性分泌液流出,鼻孔開張,鼻甲骨和鼻鏡充血并變紅,又名“紅鼻子病”。隨病情的發(fā)展,常表現(xiàn)出不同程度的呼吸困難癥狀,但咳嗽并不經(jīng)常出現(xiàn)。育肥牛體重減輕,奶牛的泌乳量減少。無繼發(fā)感染時(shí)病程持續(xù)7 d～9 d,隨后很快好轉(zhuǎn),恢復(fù)正常。

2.2 生殖道型

本病的生殖道型俗稱交合疹、交媾疹。傳染性膿皰性外陰-陰道炎的潛伏期較短,一般為24 h～72 h,隨后是持續(xù)數(shù)天的輕度波浪式體溫反應(yīng)。外陰部發(fā)生輕度腫脹,黏膜發(fā)炎,表面散在多量白色小膿皰,嚴(yán)重的外陰表面的膿皰融合成淡黃色斑塊和痂皮,結(jié)痂脫落后形成圓形裸露的表面。臨床康復(fù)需10 d～14 d,陰道分泌物可持續(xù)數(shù)周,孕牛一般不發(fā)生流產(chǎn),病程約2周。公牛感染,潛伏期2 d～3 d,在生殖道黏膜充血的同時(shí)表現(xiàn)一過性體溫升高,數(shù)天后痊愈。較重病例呈現(xiàn)同母牛一樣的體溫升高和膿皰形成兩種癥狀,后者主要見于包皮皺褶和陰莖頭,數(shù)天后膿皰破潰,徹底痊愈需2周左右。

2.3 腦炎型

本病的腦炎型多發(fā)于犢牛,主要表現(xiàn)為腦膜炎,病牛共濟(jì)失調(diào),先沉郁后興奮或沉郁興奮交替發(fā)生,吐沫,驚厥,最后臥倒,角弓反張。發(fā)病率低,但病死率高。成田實(shí)報(bào)道,將分離于自然發(fā)病牛的中樞神經(jīng)組織、鼻液和流產(chǎn)胎兒的IBRV株接種到犢牛的鼻腔、眼結(jié)膜和口腔后,可見發(fā)熱和水樣鼻液,但無神經(jīng)癥狀。但接種任何病毒株的牛在病理組織學(xué)上均能見到神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞增生和細(xì)胞管套狀浸潤(rùn)形成的三叉神經(jīng)炎及以延髓感覺神經(jīng)通路為主要部位的非化膿性腦炎。據(jù)此認(rèn)為,非化膿性感覺神經(jīng)節(jié)炎和腦脊髓炎與黏膜炎癥一樣都是IBR主要的特征性病變。

2.4 結(jié)膜炎型

本病的結(jié)膜炎型多為角膜、結(jié)膜炎,常表現(xiàn)角膜下水腫,其上形成灰色壞死膜,呈顆粒狀,眼、鼻流出漿性或膿性分泌物。有時(shí)可與呼吸道型同時(shí)發(fā)生。

2.5 流產(chǎn)型

本病的流產(chǎn)型見于初產(chǎn)青年母牛懷孕期的任何階段,有時(shí)也見于經(jīng)產(chǎn)牛。常見于懷孕5月～8月流產(chǎn),多無前驅(qū)癥狀,胎衣不滯留。主要表現(xiàn)為突然發(fā)病,厭食,體溫升高達(dá)39.5℃～42℃,結(jié)膜發(fā)炎,流鼻液,有的大量流涎,咳嗽,呼吸加速,病程約5 d。

3 病原學(xué)診斷

3.1 包涵體檢查

因本病毒可在牛胚腎、睪丸、肺和皮膚的培養(yǎng)細(xì)胞中生長(zhǎng),并形成核內(nèi)包涵體,故可用感染的單層細(xì)胞涂片,用 Lendrum染色法染色,鏡檢細(xì)胞核內(nèi)包涵體,細(xì)胞核染成藍(lán)色,包涵體染成紅色,膠原為黃色。也可采取病牛病變部的上皮組織(上呼吸道、眼結(jié)膜、角膜等組織)制作切片后染色、鏡檢[1]。

3.2 病毒分離鑒定

根據(jù)臨床癥狀不同,采集不同的樣品:鼻氣管炎以棉拭子采取處于發(fā)熱期的鼻液和眼分泌物;外陰-陰道炎時(shí)采取外陰部黏膜和陰道分泌物,公牛則采集精液和包皮的生理鹽水沖洗物;有流產(chǎn)胎兒時(shí)采取胎兒胸水、心包液、心血及肺等實(shí)質(zhì)臟器;腦炎時(shí)采取腦組織。所有樣品均應(yīng)懸浮于運(yùn)輸培養(yǎng)基(含抗生素和20 mL/L犢牛血清的組織培養(yǎng)液)儲(chǔ)存于4℃,并迅速送到實(shí)驗(yàn)室。樣品送到實(shí)驗(yàn)室后,將拭子在運(yùn)輸培養(yǎng)基中充分?jǐn)噭?dòng)以便洗脫病毒,室溫放置30 min再取出拭子,將運(yùn)輸液1 500 r/min離心10 min,取上清液作病毒分離的樣品。進(jìn)行病毒分離的精液需經(jīng)特殊處理,因?yàn)榫褐泻袑?duì)細(xì)胞有毒或?qū)Σ《驹鲋秤幸种谱饔玫拿负推渌蜃覽3]。

最常用于IBRV病毒分離的是牛胎腎或睪丸的單層細(xì)胞培養(yǎng)物,原代和次代均可。其次是豬胎腎細(xì)胞、牛腎繼代細(xì)胞和牛氣管繼代細(xì)胞。當(dāng)使用24孔培養(yǎng)板分離時(shí),每孔需接種細(xì)胞培養(yǎng)物上清液100 μ L ～ 200 μ L,吸附 1 h 后傾去液 體,加 入維持液。每天觀察細(xì)胞病變情況,一般于接種后3 d出現(xiàn)細(xì)胞病變(cytopathic effect,CPE)。細(xì)胞的典型變化是圓縮、聚集成葡萄樣群落,在單層細(xì)胞上形成空洞,有時(shí)會(huì)發(fā)現(xiàn)有數(shù)個(gè)細(xì)胞核的巨大細(xì)胞。若7 d還不出現(xiàn)CPE,應(yīng)再盲傳1次,將培養(yǎng)物經(jīng)反復(fù)凍融后離心,取其上清液用于接種新的單層細(xì)胞做進(jìn)一步病毒分離。為鑒定致細(xì)胞病變的病毒是否為IBRV,細(xì)胞培養(yǎng)的上清液必須與特異IBRV抗血清或單克隆抗體(monoclonal antibody,MAb)進(jìn)行中和試驗(yàn)[3]。

李琳琳等[4]利用MDBK細(xì)胞從進(jìn)口種用奶牛鼻咽分泌物中分離出一株牛傳染性鼻氣管炎病毒,該病毒在MDBK細(xì)胞上產(chǎn)生明顯的CPE,用抗IBRV特異性抗血清能中和分離株,并且用PCR擴(kuò)增出特異性條帶。王延濤[5]從黑龍江某養(yǎng)牛場(chǎng)發(fā)病牛陰道分泌物中分離出一株病毒,可被IBRV陽(yáng)性血清所中和,用特異性引物能擴(kuò)增出目的片段,通過理化特性分析和核酸序列分析證明是IBRV。

3.3 病毒核酸檢測(cè)

病毒核酸的檢測(cè)具有快速、特異、敏感、價(jià)廉等優(yōu)點(diǎn),解決了血清學(xué)診斷方法的許多缺陷,如各種方法診斷結(jié)果不一致、潛伏感染的動(dòng)物檢測(cè)抗原困難等,因此,近年來病毒核酸檢測(cè)在臨床診斷中得到了廣泛的應(yīng)用。

3.3.1 聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)檢測(cè)技術(shù) 1993年Van der Engelenburg、Vilcek和Wiedman等建立了IBRV的聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)診斷方法,盡管不能完全替代單克隆抗體和免疫熒光法,但由于其靈敏度高和特異性強(qiáng)而應(yīng)用于牛血清中微量IBRV的檢測(cè)等方面。Rocha M A等建立了高度敏感的IBRV套式PCR檢測(cè)方法,能夠檢測(cè) 10-3TCID50/50 μ L的細(xì)胞上清液。Frederick以 IBRV TK基因?yàn)槟０?對(duì)4株野毒株擴(kuò)增出183 kb的特異片段;Kibenge和Yason也是在 TK基因區(qū)分別設(shè)計(jì)了一對(duì)引物,建立了IBRV的PCR檢測(cè)方法。Santurde G等[6]用Chelex100樹脂吸附方法快速提取臨床樣品中的核酸增加了檢測(cè)的靈敏度,這種PCR測(cè)定方法成本較低,可以作為血清庫(kù)IBRV監(jiān)測(cè)的有效工具。Takiuchi等[7]建立了一種IBRV套式PCR檢測(cè)方法,從巴西某牛場(chǎng)死產(chǎn)胎兒中檢測(cè)到IBRV,該方法可以有效而快速的對(duì)牛場(chǎng)的IBRV感染進(jìn)行診斷。

在國(guó)內(nèi),張桂紅等[8]建立了IBRV PCR診斷方法,該方法特異而敏感,可以應(yīng)用于臨床上病原的快速檢測(cè)。

徐淑菲等[9]根據(jù)IBRV gB基因序列設(shè)計(jì)一對(duì)引物,進(jìn)行PCR檢測(cè),并對(duì)反應(yīng)條件及反應(yīng)體系進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果得到與預(yù)期大小(362 bp)一致的特異性片段。用這對(duì)引物擴(kuò)增IBRV、豬瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)、豬偽狂犬病毒(Pseudorabies virus,PRV),只有IBRV擴(kuò)增出特異性條帶。該P(yáng)CR方法的檢測(cè)靈敏度為2.4 ng/100μ L,較其他方法敏感。

楊少華等[10]采用采用SDS-蛋白酶K法提取病毒核酸。根據(jù)IBRV gB基因序列設(shè)計(jì)了1對(duì)特異引物,在其上下游引物的內(nèi)側(cè)又分別設(shè)計(jì)了1對(duì)引物,以這4條引物對(duì)IBRV模板進(jìn)行擴(kuò)增。結(jié)果成功擴(kuò)增出預(yù)期目的片段,建立了套式PCR檢測(cè)方法。敏感性、特異性試驗(yàn)結(jié)果表明該方法能特異檢測(cè)IBRV。本方法具有快速、靈敏、特異的優(yōu)點(diǎn),適用于在牛及其遺傳物質(zhì)的進(jìn)出口檢疫中進(jìn)行IBRV快速檢測(cè)。楊娟[11]根據(jù)已發(fā)表的IBRV gB基因序列,合成了2條引物,優(yōu)化了反應(yīng)條件,分別對(duì)IBRV的Bartha Nu/67株,IBRV-BK125株DNA模板進(jìn)行擴(kuò)增,結(jié)果對(duì)2株IBRV DNA均可擴(kuò)增出362 bp的特異性片段;對(duì)豬偽狂犬病毒(PRV)、火雞皰疹病毒(Herpesvirus of turkeys,HVT)及牛病毒性腹瀉病毒(Bovine viral diarrhea virus,BVDV)進(jìn)行擴(kuò)增均未見特異性條帶。靈敏性檢測(cè)表明,該法對(duì)IBRV的檢出限量為711TCID50。將該P(yáng)CR方法進(jìn)行初步應(yīng)用,與病毒分離所得結(jié)果基本一致。

3.3.2 核酸探針檢測(cè)技術(shù) 近幾年來,核酸探針已被廣泛應(yīng)用于病毒感染的檢測(cè),由于此法檢測(cè)的陽(yáng)性結(jié)果可以直接確定為IBRV的攜帶者,為流行病學(xué)調(diào)查和臨床確診提供了直接依據(jù),要比傳統(tǒng)的血清學(xué)方法更為敏感、特異。吳時(shí)友等從純化的IBRV中提取全基因組DNA,用32P標(biāo)記作為探針進(jìn)行雜交,結(jié)果表明,該探針可檢出10 pg的IBRV DNA,能明顯區(qū)分IBRV感染細(xì)胞和未感染的正常細(xì)胞,具有相當(dāng)高的靈敏度和特異性。隨后用生物素代替32P制備的探針也取得了相同的結(jié)果,能檢測(cè)牛精液中 IBRV DNA。由于此探針可在-20℃保存1年以上,有利于推廣使用,又可彌補(bǔ)放射性同位素探針半衰期短及對(duì)人體健康有害的弊端。Pandita和Xia等報(bào)道了用斑點(diǎn)雜交法檢測(cè)IBRV。

唐泰山等[12]根據(jù)IBRV的保守基因gB和gE序列,分別設(shè)計(jì)了2對(duì)引物及其相應(yīng)的TaqMan探針,建立并優(yōu)化反應(yīng)體系后,利用10倍稀釋的病毒進(jìn)行擴(kuò)增以檢測(cè)其靈敏度,同時(shí)對(duì)偽狂犬病病毒(PRV)、馬立克病病毒(MDV)、鴨瘟病毒(DPV)進(jìn)行特異性檢測(cè)。結(jié)果顯示,建立的擴(kuò)增gB和gE基因的熒光PCR可用于檢測(cè)IBRV,其靈敏度為0.02 TCID50,而與PRV等其他病毒無交叉反應(yīng),具有快速、靈敏、準(zhǔn)確、低污染等優(yōu)點(diǎn),可用于IBRV的檢測(cè)。

4 血清學(xué)診斷

為控制IBRV的傳播,消除該病的有效方法是對(duì)所有采集的血清進(jìn)行監(jiān)測(cè)。通常將血清中和試驗(yàn)(SN)、免疫熒光(FA)、瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)、間接血凝試驗(yàn)(IHA)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)等方法用于診斷IBRV急性感染和潛伏感染的動(dòng)物。下面具體介紹一下常用的血清學(xué)方法。

4.1 中和試驗(yàn)

中和試驗(yàn)是本病最常用的血清學(xué)診斷方法。用IBRV種毒接種牛腎單層細(xì)胞,在細(xì)胞病變最明顯時(shí)收獲培養(yǎng)物,凍融2次,離心去除細(xì)胞碎片,收集上清。測(cè)定細(xì)胞半數(shù)感染量后等量分裝,置-70℃保存?zhèn)溆谩１粰z血清經(jīng)56℃滅30 min。實(shí)驗(yàn)時(shí)將被檢血清與等量的含100 TCID50病毒量的新鮮抗原混合,37℃孵育1 h后接種4管細(xì)胞培養(yǎng)物,室溫吸附1 h,再加入 pH 7.2～7.4細(xì)胞維持液,置37℃培養(yǎng),72 h后判定。當(dāng)未稀釋血清能抑制50%或50%以上細(xì)胞管出現(xiàn)CPE者判為陽(yáng)性。實(shí)驗(yàn)時(shí)必須做病毒抗原、標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清及陰性血清的對(duì)照,病毒抗原對(duì)照和陰性血清加抗原對(duì)照應(yīng)出現(xiàn)細(xì)胞病變;陽(yáng)性血清加抗原對(duì)照應(yīng)無細(xì)胞病變;被檢血清對(duì)細(xì)胞應(yīng)無毒性,對(duì)照細(xì)胞正常生長(zhǎng)。

4.2 瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)

用已知的IBRV抗原檢查被檢血清中的沉淀抗體,也可用IBR陽(yáng)性血清檢測(cè)病料標(biāo)本或細(xì)胞培養(yǎng)物的相應(yīng)抗原。Suresh曾用免疫擴(kuò)散法和對(duì)流免疫擴(kuò)散法檢測(cè)IBRV。

4.3 間接血凝試驗(yàn)

鞣酸處理法間接血凝試驗(yàn)(IHA)是簡(jiǎn)單易行的血清抗體檢測(cè)法?？捎贸Ｒ?guī)的試管凝集法或微量凝集法進(jìn)行。Dai曾用間接血凝試驗(yàn)檢測(cè) IBRV抗體,陳天祥等在1987年就報(bào)道,IHA是一種簡(jiǎn)單、快速、準(zhǔn)確的血清學(xué)診斷方法。

4.4 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)

曲新勇等用牦牛 IBRV85-Y株按 Cho等方法制備的抗原,經(jīng)ELISA測(cè)定,表明其抗原性好,特異性強(qiáng),操作簡(jiǎn)單、快速,使用于一般實(shí)驗(yàn)室,并比中和試驗(yàn)敏感。Florent應(yīng)用 IBRV IgM 抗體捕獲ELISA法進(jìn)行IBRV的早期感染檢測(cè)。以針對(duì)牛IgM的第一單抗作為捕獲抗體,而第二單抗用來測(cè)定特異性抗病毒抗體。經(jīng)試驗(yàn)感染和自然感染動(dòng)物的血清檢品檢測(cè),表明在臨床癥狀出現(xiàn)后5 d～10 d的血清樣品即可診斷出IBRV感染。Achilles于1990年建立了雙抗夾心ELISA法,Kramps于1994年報(bào)道了ELISA是敏感、特異的檢測(cè)方法。ELISA方法快速、準(zhǔn)確、方便,已成為了目前檢測(cè)IBRV的主要方法之一。

朱遠(yuǎn)茂等[13]成功的建立了檢測(cè)牛血清IBRV抗體的間接ELISA方法,特異性和重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果表明,該方法特異性高、重復(fù)性好。與法國(guó)進(jìn)口ELISA抗體診斷試劑盒比較,其符合率為96.3%,與中和試驗(yàn)比較,符合率為95.8%,且敏感性更高。

李兆利等[14]在國(guó)內(nèi)首次利用重組gB蛋白建立了牛傳染性鼻氣管炎間接ELISA診斷方法,該方法具有操作簡(jiǎn)便、快速、無需進(jìn)行組織培養(yǎng)、易于推廣、檢測(cè)樣本量大等優(yōu)點(diǎn)。通過交叉試驗(yàn)、比較試驗(yàn)等表明其靈敏度高、特異性好,從整體來看該方法優(yōu)于傳統(tǒng)的血清學(xué)方法,在IBR的普查檢測(cè)、流行病學(xué)調(diào)查以及臨床診斷中具有良好的應(yīng)用前景。

王海燕[15]以純化的IBRV Bartha Nu/67株建立了檢測(cè)牛血清IBRV抗體的間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)。該診斷方法特異性高、重復(fù)性好,可用于流行病學(xué)調(diào)查。同時(shí)利用純化的重組蛋白 pET32gEE建立了檢測(cè)牛血清特異性gE抗體的間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(gE-ELISA)。gE-ELISA診斷方法具有較高的特異性、重復(fù)性和敏感性,可用于區(qū)別gE缺失疫苗株及非缺失株誘導(dǎo)所產(chǎn)生的抗體。

楊娟[11]以 IBR山羊腎細(xì)胞病毒液作為包被抗原,建立了檢測(cè)IBRV血清抗體的間接ELISA方法,并優(yōu)化了反應(yīng)條件和系統(tǒng),利用該方法檢測(cè)138份臨床血清樣品,與中和試驗(yàn)相比較,特異性為93.5%,敏感性為 93.5%,符合率為93.5%;與IDEXX試劑盒相比,符合率為 97.6%。利用該方法檢測(cè)本實(shí)驗(yàn)室保存的230份牛血清,168份為陽(yáng)性,與IDEXX試劑盒相比,符合率為87.8%;檢測(cè)35份IBR感染的牦牛血清,21份為陽(yáng)性,與中和試驗(yàn)相比,符合率為85.7%。

祖立闖等[16]用大腸埃希菌表達(dá)的IBRV重組gD蛋白純化后作為包被抗原,建立了檢測(cè)牛傳染性鼻氣管炎病毒抗體的間接ELISA方法。與中和試驗(yàn)相比較,符合率、敏感性和特異性分別為84.1%、85.0%、83.4%。該方法具有良好的敏感性和特異性,為國(guó)內(nèi)IBR流行病學(xué)調(diào)查提供了一種快速、簡(jiǎn)便的血清學(xué)診斷方法。

4.5 變態(tài)反應(yīng)診斷

本法的檢出率約為中和試驗(yàn)的2/3,但在缺乏實(shí)驗(yàn)室條件的地區(qū)是一種較為實(shí)用的診斷方法。應(yīng)用一種滅活抗原(經(jīng)膜超濾濃縮,再56℃加熱 1 h和β-丙內(nèi)酯處理的感染細(xì)胞培養(yǎng)液)進(jìn)行接種。接種后20 min～30 min、6 h及72 h連續(xù)觀察接種部位的皮膚,并檢測(cè)紅斑性腫脹的直徑厚度,72 h作出最后判定,反應(yīng)區(qū)直徑在 1 cm以上者為陽(yáng)性,0.5 cm～1 cm之間為可疑,0.5 cm以下判為陰性。

5 鑒別診斷

5.1 單克隆抗體技術(shù)

單克隆抗體技術(shù)的應(yīng)用,使人類對(duì)IBRV的鑒別診斷提高到了一個(gè)新的水平,它的最大特點(diǎn)是通過單克隆抗體可以將疫苗免疫動(dòng)物與自然感染動(dòng)物有效地分開。一些發(fā)達(dá)國(guó)家規(guī)定,標(biāo)記疫苗的使用必須有配套的鑒別診斷方法。因此根據(jù)疫苗株和缺失株所缺失的糖蛋白,各國(guó)學(xué)者已建立了抗gE、gC和gB的單抗,其中以 gE占主導(dǎo)地位。Van Oirschot制備了gE和gB兩株單抗用來診斷 gE缺失株與野毒株感染[17]。Kit S等[18]用抗gC糖蛋白的單抗(McAb gC)鑒別診斷g缺失株、野毒感染株和TK基因缺失株。

王海燕[15]獲得了3株分泌抗 IBRV單克隆抗體(McAb)的雜交瘤細(xì)胞;2株分泌抗gEE單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞和2株分泌抗 gEB單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞。這些單克隆抗體用雙抗體夾心ELISA試驗(yàn)可區(qū)別IBRV陽(yáng)性血清與陰性血清;同時(shí)gEE單抗和gEB單抗可初步區(qū)別 gE缺失株和gE非缺失株,為區(qū)別gE缺失標(biāo)記疫苗株和自然感染株的鑒別診斷方法奠定了基礎(chǔ)。

陳锃[19]利用純化的病毒 IBRV Bartha Nu/67株作為免疫原,建立了一株穩(wěn)定分泌抗IBRV gG蛋白McAb的雜交瘤細(xì)胞株E12,為建立能區(qū)分缺失病毒與野生病毒的分子鑒別診斷方法提供了材料。

王延濤[20]通過IBRV DQ01株全病毒蛋白免疫小鼠,細(xì)胞融合后篩選獲得3株穩(wěn)定分泌單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株。把雜交瘤細(xì)胞注入小鼠腹腔,生產(chǎn)了高效價(jià)的腹水(1∶16 000～1∶256 000),為IBRV的診斷提供了一定的基礎(chǔ)材料。

5.2 PCR鑒別診斷技術(shù)

以IBRV的保守基因?yàn)槟０?利用引物可對(duì)IBRV的潛伏感染進(jìn)行確診,此法特異性強(qiáng)、費(fèi)時(shí)少,可用于活體檢查,具有較大的使用價(jià)值。

陳茹等[21]采用LUX新型熒光PCR技術(shù)原理,以牛皰疹病毒I型(Bovine herpesvirus 1,BHV-1)的gC、gE基因?yàn)榘谢?建立了快速檢測(cè)牛皰疹病毒I型以及鑒別野毒感染和基因缺失疫苗免疫動(dòng)物的二重實(shí)時(shí)熒光PCR方法。采用該方法從臨床牛血樣、鼻拭子樣品中檢出BHV-1陽(yáng)性樣品,檢測(cè)全程僅需約2 h。該方法可應(yīng)用于臨床快速診斷BHV-1病毒感染,鑒別BHV-1病毒感染與對(duì)應(yīng)的基因缺失疫苗免疫動(dòng)物。張桂紅等[22]參照已發(fā)表的IBRV gB和TK基因序列,設(shè)計(jì)了兩對(duì)引物,分別對(duì)已構(gòu)建TK基因缺失(TK-)IBRV以及Bartha Nu/67株、美精株、洛精株、LA 株、B7株及云南株的IBRV進(jìn)行擴(kuò)增,均得到339 bp和457 bp的特異性片段,而T K-IBRV只出現(xiàn)110 bp的片段,擴(kuò)增其它病毒未出現(xiàn)特異性條帶,證明此法特異性強(qiáng)、建立的方法可以鑒別牛傳染性鼻氣管炎病毒野毒與TK基因缺失疫苗毒的感染。Fuchs M等[23]建立了一種敏感的PCR檢測(cè)方法,可以鑒別診斷IBRV野毒和gE缺失疫苗毒的感染,有效的從自然感染IBRV的牛群外周血中檢測(cè)到IBRV。

鄧碧華等[24]根據(jù)野毒株和gE基因缺失疫苗株共有的IBRV gB基因序列設(shè)計(jì)了一套引物,又根據(jù)IBRV gE基因序列設(shè)計(jì)了另一套引物,建立了檢測(cè)IBRV的套式PCR方法,該方法敏感性高、特異性強(qiáng)、操作方便,能夠檢測(cè)IBRV及有效區(qū)分IBRV野毒株和gE基因缺失疫苗株,可為IBRV診斷、監(jiān)測(cè)和研究提供有效手段。

6 結(jié)語

隨著我國(guó)規(guī)模化養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展,牛傳染性鼻氣管炎的威脅也與日俱增。隨著科學(xué)技術(shù)的進(jìn)步,對(duì)該病的診斷方法在不斷的完善,快速、有效、敏感的診斷方法在臨床上得到了廣泛的應(yīng)用。而對(duì)于獸醫(yī)工作者來說,加強(qiáng)預(yù)防與控制,根除該病是最終目的。疫苗的研究在許多國(guó)家得到了開展[25],但由于IBRV的潛伏感染的特性,除了通過禁止接種、撲殺血清陽(yáng)性牛還沒有更好的方法來根除本病。因此,國(guó)內(nèi)外的研究者應(yīng)引起足夠的重視。研究高效能的疫苗,消滅該病是今后獸醫(yī)工作的一項(xiàng)艱巨任務(wù),相信隨著多基因缺失苗和病毒活載體重組苗的成功研制,根除IBR的計(jì)劃將會(huì)在世界各地相繼展開。

[1]殷 震,劉景華.動(dòng)物病毒學(xué)[M].2版.北京:科學(xué)出版社,1997:1019-1029.

[2]Moretti B,Orfei Z,Mondino G,et al.Infectious bovine rhinotracheitis,clinical observations and isolation of virus[J].Vet Ital,1964,15:676.

[3]饒 輝.牛傳染性鼻氣管炎診斷技術(shù)研究進(jìn)展[J].獸醫(yī)導(dǎo)刊,2008,134(10):24-25

[4]李琳琳,謝懷根.從進(jìn)口種用奶牛中分離傳染性鼻氣管炎病毒[J].中國(guó)草食動(dòng)物,2008,28(4):57-78.

[5]王延濤.牛傳染性鼻氣管炎病毒分離鑒定及其抗克隆抗體制備[D].黑龍江大慶:黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué),2008.

[6]Santurde G,Da Silva N,Villares R,et al.Rapid and hig h sensitivity test for direct detection of bovine herpesvirus-1 genome in clinical samples[J].Vet Microbiol,1996,49:81-92.

[7]Takiuchi E,Medici K C,Alfieri A F,et al.Bovine herpesvirus type 1 abortions detected by a semi-nested PCR in Brazilian cattle herds[J].Res Vet Sci,2005,79:85-88.

[8]張桂紅,童光志,王 柳,等.牛傳染性鼻氣管炎病毒PCR診斷方法的研究[J].黑龍江畜牧獸醫(yī),2000(4):1-2.

[9]徐淑菲,孔繁德,周斌華.牛傳染性鼻氣管炎 PCR檢測(cè)方法的建立[J].中國(guó)動(dòng)物檢疫,2006,23(11):26-28.

[10]楊少華,王長(zhǎng)法,高運(yùn)東,等.利用巢式PCR快速鑒定牛傳染性鼻氣管炎[J].家畜生態(tài)學(xué)報(bào),2007,28(4):81-83.

[11]楊 娟.牛傳染性鼻氣管炎的快速診斷[D].北京:中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所,2008.

[12]唐泰山,鄧碧華,王凱英,等.牛傳染性鼻氣管炎病毒實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法的建立[J].動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展,2009,30(4):14-16.

[13]朱遠(yuǎn)茂,王海燕,薛 飛.牛傳染性鼻氣管炎間接ELISA診斷方法的建立[J].中國(guó)獸醫(yī)科技,2005,35(12):959-963.

[14]李兆利,薛 飛,朱遠(yuǎn)茂.牛傳染性鼻氣管炎病毒gB基因的截短表達(dá)與間接 ELISA診斷方法的建立[J].畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào),2006,37(12):1328-1333.

[15]王海燕.IBR間接ELISA的建立及重組gE糖蛋白與單抗的研制[D].吉林長(zhǎng)春:吉林大學(xué),2006.

[16]祖立闖,朱遠(yuǎn)茂,王延輝,等.牛傳染性鼻氣管炎病毒重組gD蛋白間接ELISA方法的建立及應(yīng)用[J].中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào),2008,30(7):537-543.

[17]Van Oirschot J T,Kaashoek M J,M aris-Veldhuis M A.An enzyme-linked immunosorbent assay to detect antibodies against glycoprotein gE of bovine herpesvirus 1 allows differentiation between infected and vaccinated cattle[J].J Virol M ethods,1997(67):23-34.

[18]Kit S,Otsuka H,Kit M.Blocking ELISA for distinguishing infectious bovine rhinotracheitis virus(IBRV)-infected animals from those vaccinated with a gene-deleted marker vaccine[J].J Virol Methods,1992,40:45-56.

[19]陳 锃.牛傳染性鼻氣管炎病毒gG缺失株構(gòu)建及gG單克隆抗體制備[D].湖北武漢:華中農(nóng)業(yè)大學(xué),2008.

[20]王延濤.牛傳染性鼻氣管炎病毒分離鑒定及其抗克隆抗體制備[D].黑龍江大慶:黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué),2008.

[21]陳 茹,劉琳琳,曾彩云.牛皰疹病毒I型(BHV-1)二重 LUX熒光PCR鑒別檢測(cè)方法的建立[J].中國(guó)獸醫(yī)科學(xué),2007,37(11):944-949.

[22]張桂紅,童光志,王 柳,等.牛傳染性鼻氣管炎病毒TK基因缺失株與野毒株P(guān)CR鑒別診斷方法的研究[J].中國(guó)獸醫(yī)科技,1999,29(5):3-5.

[23]Fuchs M,Hubert P,Detterer J,et al.Detection of Bovine herpesvirus type 1 in blood from naturally infected cattle by using a sensitive PCR that discriminates between wild-type virus and virus lacking glycoprotein E[J].Clin Microbiol,1999,37(8):2498-2507.

[24]鄧碧華,王凱英,唐泰山,等.牛傳染性鼻氣管炎病毒套式PCR檢測(cè)方法的建立[J].中國(guó)獸醫(yī)學(xué)報(bào),2008,28(6):649-651.

[25]Castruccci G,Figeri F,Salvatori D,et al.Vaccination of calves against bovine heresvirus-1:Assessment of the protective value of eight vaccines[J].Comp Immunol Infec Dis,2002,25:29-41.