SSR標(biāo)記及其在園藝植物育種中的應(yīng)用

苗明軍，李成瓊，司軍

（西南大學(xué)園藝園林學(xué)院，重慶北碚，400715）

真核基因組中廣泛存在著由1～6個(gè)堿基對(duì)組成的簡(jiǎn)單重復(fù)序列 （Simple Sequence Repeats,SSR），又稱(chēng)為微衛(wèi)星DNA[1]。SSR廣泛分布于真核生物基因組中，少數(shù)原核生物基因組中也有[2]，而且分布比較均勻，每隔10～50 kb就存在1個(gè)微衛(wèi)星[1]，其主要以兩個(gè)核苷酸為重復(fù)單位，也有一些微衛(wèi)星重復(fù)單位為3個(gè)核苷酸，少數(shù)為 4 個(gè)核苷酸或者更多，如（CA）n、（GA） n、（GAA）n、（GATA）n 等。人和動(dòng)物中的微衛(wèi)星重復(fù)單位主要為（TG），植物基因組中（AT）重復(fù)較（AC）重復(fù)更為普通[3]。SSR標(biāo)記因?yàn)榫哂泄诧@性、高度重復(fù)性、高度豐富的多態(tài)性等優(yōu)點(diǎn)，成為構(gòu)建遺傳連鎖圖譜、基因定位、品種指紋圖譜繪制、品種純度檢測(cè)、分子標(biāo)記輔助育種、目標(biāo)性狀分子標(biāo)記篩選的理想工具。目前，在植物基因組中SSR標(biāo)記研究非常活躍，已在擬南芥、花生、葡萄、蘋(píng)果、番茄、辣椒、甜菜等多種園藝植物上得到廣泛的應(yīng)用。本文主要綜述SSR標(biāo)記的原理、特點(diǎn)及其在園藝植物育種方面的應(yīng)用。

1 SSR標(biāo)記技術(shù)原理及特點(diǎn)

1.1 SSR標(biāo)記技術(shù)的特點(diǎn)

SSR應(yīng)用廣泛是因其具有以下特點(diǎn)：①SSR標(biāo)記數(shù)量豐富，標(biāo)記覆蓋整個(gè)基因組，而且分布均勻；②SSR標(biāo)記為顯性標(biāo)記，呈孟德?tīng)柺竭z傳，具有很好的穩(wěn)定性和多態(tài)性，因而能夠鑒定純合體和雜合體；③DNA用量少，僅需微量組織，且DNA有點(diǎn)降解也能進(jìn)行分析鑒定；④具有多等位基因的特性，提供的信息量大；⑤技術(shù)要求低，易于實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化；⑥引物序列公開(kāi)發(fā)表，易在各實(shí)驗(yàn)中廣為傳播使用。與其他分子標(biāo)記（AFLP、RAPD、RFLP等）相比，所測(cè)的位點(diǎn)多態(tài)性明顯高于RFLP標(biāo)記，而且重復(fù)性優(yōu)于RAPD，與AFLP相比，不同的材料結(jié)果略有不同。所以SSR兼有RFLP和RAPD的優(yōu)點(diǎn)，克服了它們的不足。SSR標(biāo)記能夠在短時(shí)間內(nèi)對(duì)大量樣品進(jìn)行分析，具有更強(qiáng)的實(shí)用性和更大的應(yīng)用前景，成為目前分子標(biāo)記技術(shù)的熱點(diǎn)。

1.2 SSR標(biāo)記技術(shù)的原理

SSR標(biāo)記是指由1～6個(gè)堿基組成的基本序列串聯(lián)重復(fù)組成的短片段，是建立在PCR反應(yīng)基礎(chǔ)上的共顯性標(biāo)記。SSR的產(chǎn)生是在DNA復(fù)制或修復(fù)過(guò)程中DNA滑動(dòng)和錯(cuò)配或者有絲分裂、減數(shù)分裂時(shí)姊妹染色單體分配不均等交換的結(jié)果[4]。不同遺傳材料重復(fù)次數(shù)的可變性，導(dǎo)致了SSR長(zhǎng)度的高度變異性，這一變異性正是SSR標(biāo)記產(chǎn)生的基礎(chǔ)。微衛(wèi)星的突變率很高，從而產(chǎn)生了很多的等位基因，導(dǎo)致了微衛(wèi)星的高度多態(tài)性。盡管微衛(wèi)星DNA分布于整個(gè)基因組的不同位置，但其兩端序列是保守的單拷貝序列，據(jù)此可以設(shè)計(jì)一對(duì)特異引物，對(duì)基因DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將擴(kuò)增產(chǎn)物在高分辨率的聚丙烯酰胺凝膠或瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳分離，從而檢測(cè)出DNA的多態(tài)性，即檢測(cè)出不同個(gè)體在每個(gè)微衛(wèi)星座位上遺傳結(jié)構(gòu)的差別[5]。

2 SSR標(biāo)記在園藝植物育種研究中的應(yīng)用

2.1 親緣關(guān)系和遺傳多樣性的研究

SSR標(biāo)記具有高度多態(tài)性且信息豐富，能夠準(zhǔn)確區(qū)分大量的等位基因，因而可以區(qū)分同一物種不同基因型，甚至是親緣關(guān)系特別近的材料，也是遺傳差異研究的主要工具。Scott等[6]根據(jù)從5 000個(gè)葡萄表達(dá)序列標(biāo)簽（ESTS）中分離的124個(gè)微衛(wèi)星而設(shè)計(jì)的16對(duì)SSR引物，對(duì)7個(gè)葡萄資源進(jìn)行分析。結(jié)果表明，在3'非翻譯區(qū)（3'UTR）分離的微衛(wèi)星在品種間具有較高的多態(tài)性；在5'非翻譯區(qū)（5'UTR）分離的微衛(wèi)星在種和品種間具有較高的多態(tài)性；而在編碼區(qū)分離的微衛(wèi)星在種和屬間具有較高的多態(tài)性。宋建等[7]從400對(duì)SSR引物中篩選出24對(duì)多態(tài)性高、擴(kuò)增穩(wěn)定、重復(fù)性好的引物，對(duì)來(lái)自國(guó)內(nèi)外的36份番茄材料進(jìn)行SSR標(biāo)記，之后利用NTSYS軟件對(duì)所得結(jié)果進(jìn)行聚類(lèi)分析，36份材料被聚成7大類(lèi)，說(shuō)明番茄材料之間存在一定程度的遺傳分化，野生種的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)；而栽培番茄的親緣關(guān)系較近，遺傳背景狹窄；野生種與栽培品種之間的親緣關(guān)系也較遠(yuǎn)。

遺傳多樣性是指種內(nèi)不同種群之間或一個(gè)種群內(nèi)不同個(gè)體間的遺傳變異。它是園藝植物種質(zhì)資源利用和保護(hù)的基礎(chǔ)。SSR標(biāo)記揭示的多態(tài)性水平高，非常適用于遺傳分析和系統(tǒng)進(jìn)化研究。Smulders等[8]對(duì)番茄栽培和其他的番茄種中用44個(gè)微衛(wèi)星引物研究后發(fā)現(xiàn)，其中的36對(duì)引物能擴(kuò)增出片段，29對(duì)（86%）微衛(wèi)星標(biāo)記在其他的番茄種中表現(xiàn)出DNA多態(tài)性，10對(duì)（28%）引物在7個(gè)栽培種中表現(xiàn)出多態(tài)性，平均每個(gè)位點(diǎn)檢測(cè)到等位基因2～4個(gè)，有的位點(diǎn)最多可檢測(cè)到的等位基因數(shù)為8個(gè)，結(jié)果表明這些SSR標(biāo)記可用于親緣關(guān)系較近的番茄品種間的鑒定。Kwon等[9]用316對(duì)SSR引物對(duì)在形態(tài)特性上有差異的6個(gè)辣椒品種進(jìn)行引物篩選，其27對(duì)（8.5%）表現(xiàn)出多態(tài)性。用這27對(duì)引物對(duì)66個(gè)辣椒品種進(jìn)行檢測(cè)，平均每個(gè)位點(diǎn)檢測(cè)到3.29個(gè)等位基因。Desplanque等[10]1999年用SSR試驗(yàn)了法國(guó)各地54個(gè)種群300個(gè)甜菜品種的遺傳多態(tài)性，發(fā)現(xiàn)野生甜菜比栽培甜菜表現(xiàn)明顯的遺傳多態(tài)性。唐開(kāi)學(xué)等[11]利用18對(duì)SSR引物對(duì)42份材料DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，在18個(gè)位點(diǎn)共檢測(cè)到148個(gè)等位基因，每1位點(diǎn)的等位基因變幅為6～14個(gè)，平均8.2個(gè)。材料間遺傳相似系數(shù)為0.282～0.892，表明在分子水平上具有豐富的遺傳多樣性。在相似系數(shù)為0.456時(shí)，基于SSR標(biāo)記的聚類(lèi)分析將13個(gè)薔薇野生種分為5個(gè)組，這與植物形態(tài)學(xué)分類(lèi)結(jié)果大體一致。在遺傳相似系數(shù)為0.143時(shí)，聚類(lèi)分析將42份供試材料分為5大組群。初步探討了野生種之間以及野生種與栽培品種之間的親緣關(guān)系。

穆生奇等[12]利用62對(duì)多態(tài)性SSR引物對(duì)59份黃瓜材料進(jìn)行了遺傳多樣性分析。聚類(lèi)分析結(jié)果將供試材料分為7大類(lèi)群，第1類(lèi)包含6個(gè)歐洲溫室型材料，全為無(wú)刺瘤類(lèi)型；第2類(lèi)是4個(gè)美國(guó)類(lèi)型種質(zhì)，屬于小果型材料；西雙版納黃瓜D59單獨(dú)聚為第3類(lèi)，且與其他材料的遺傳距離均大于0.33；疑為華南型種質(zhì)的D38，單獨(dú)聚為第4類(lèi)，其果實(shí)為乳白色；第5類(lèi)包括D13及其父本D39，兩者含有歐洲和華北血緣；第6類(lèi)為葉色突變材料D28，是歐洲型和華北型黃瓜的后代；第7類(lèi)包括33個(gè)華北型材料、7個(gè)華南型材料和4個(gè)日本型材料。主成分分析與系統(tǒng)聚類(lèi)分析結(jié)果基本一致。兩種分析方法的分類(lèi)結(jié)果與形態(tài)學(xué)分類(lèi)相吻合。

2.2 品種鑒定

SSR標(biāo)記對(duì)品種的鑒定實(shí)質(zhì)上是對(duì)基因型的鑒定，使品種鑒定和分類(lèi)直接從DNA分子水平上進(jìn)行，準(zhǔn)確度高，效率高，容易鑒別出同一物種的不同基因型，已成為一種有效的品種鑒定方法。SSR指紋圖譜將為品種提供獨(dú)特的鑒定特征。結(jié)合SSR多態(tài)性及其精確的片段大小，便可建立每一品種的標(biāo)準(zhǔn)圖譜，以鑒別品種。Bowers等[13]應(yīng)用SSR技術(shù)成功地鑒定了釀酒葡萄品種Cabernet-Sauvignon的親本。Garlos等[14]利用3個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記就能區(qū)分21個(gè)蘋(píng)果品種。韓宏偉等[15]根據(jù)目前基因庫(kù)中梨的DNA收錄序列設(shè)計(jì)開(kāi)發(fā)SSR引物，用篩選出的6對(duì)圖譜清晰SSR引物可以將供試的19個(gè)主要梨栽培品種鑒別分開(kāi)。Provan等[16]用SSR標(biāo)記鑒定馬鈴薯種內(nèi)體細(xì)胞雜種，這種方法可用愈傷組織檢測(cè)并且可以自動(dòng)化操作，從而大大節(jié)省常規(guī)檢測(cè)方法所需的時(shí)間和費(fèi)用。王愛(ài)德等[17]利用SSR方法對(duì)25個(gè)蘋(píng)果品種進(jìn)行了基因組多態(tài)性分析，用2對(duì)引物（GD142和02b1），即可區(qū)分全部供試品種。鄭軼琦等[18]通過(guò)對(duì)16對(duì)高多態(tài)性的獼猴桃SSR引物篩選，選用9對(duì)穩(wěn)定、適用性好的引物對(duì)我國(guó)栽培的48個(gè)獼猴桃品種（品系）進(jìn)行了初步研究，在9個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)上共獲得213個(gè)等位基因片段，其SSR指紋圖譜可將供試品種完全區(qū)分開(kāi)。Coart等[19]采用SSR和AFLP標(biāo)記，將歐洲野生森林蘋(píng)果與栽培蘋(píng)果品種基本區(qū)分開(kāi)來(lái)，并發(fā)現(xiàn)野生種在植物學(xué)性狀上與現(xiàn)代栽培品種有明顯差別。艾呈祥等[20]以兩個(gè)甜瓜雜交品種（系）“東方蜜1號(hào)”和“01-31”及其親本為材料，用SSR引物M6對(duì)“東方蜜1號(hào)”和引物M17對(duì)“01-31”各100粒單種子進(jìn)行SSR鑒定，所測(cè)純度分別為100%和96%，與田間純度99.6%和96.2%非常接近，顯示出SSR標(biāo)記技術(shù)在甜瓜雜交種子純度的室內(nèi)快速檢測(cè)中有廣泛應(yīng)用前景。王全等[21]在黃瓜上研究表明，利用60多對(duì)SSR引物對(duì)津優(yōu)1號(hào)及其親本進(jìn)行PCR擴(kuò)增，其中有1對(duì)SSR引物在雙親及雜種后代中表現(xiàn)共顯性分離，進(jìn)行雜種種子的純度鑒定，結(jié)果顯示，SSR標(biāo)記方法與田間鑒定方法可靠性都在96%以上。

2.3 構(gòu)建遺傳連鎖圖譜

遺傳圖譜是通過(guò)遺傳重組交換結(jié)果進(jìn)行連鎖分析所得到的基因在染色體上相對(duì)位置的排列圖，是植物遺傳育種及分子克隆等應(yīng)用研究的理論依據(jù)和基礎(chǔ)[22]。SSR標(biāo)記的單個(gè)位點(diǎn)具有多個(gè)等位基因，而且每一遺傳型僅有一個(gè)等位基因，多態(tài)性豐富等優(yōu)點(diǎn)，是構(gòu)建高密度分子遺傳圖譜的有效工具。Liebhard 等[23]用 475 個(gè) AFLP、235 個(gè) RAPD、129個(gè)SSR和1個(gè)SCAR共840個(gè)標(biāo)記構(gòu)建了較為飽和的蘋(píng)果遺傳圖譜，覆蓋了遺傳圖譜中1 450 cM，129個(gè)SSR標(biāo)記，分布在17條連鎖群上，這為不同構(gòu)圖群體或品種間標(biāo)記轉(zhuǎn)換、基因定位和克隆奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)，該圖是目前關(guān)于蘋(píng)果基因組的最致密的一張分子連鎖圖。Han等[24]構(gòu)建了赤豆[Vigna angularis(Willdenow)Ohwi et Ohashi]的遺傳連鎖圖譜,其中包括205個(gè)SSR標(biāo)記、187個(gè)AFLP標(biāo)記和94個(gè)RFLP標(biāo)記,它們分布于赤豆單倍體的11個(gè)連鎖組群上，總長(zhǎng)度為832.1 cM，標(biāo)記間的平均間距1.85 cM。Joobeur等[25]用RAPD和SSR標(biāo)記共同構(gòu)建了扁桃的第二代遺傳圖譜，驗(yàn)證了應(yīng)用SSR標(biāo)記補(bǔ)充已構(gòu)建的連鎖圖或新建果樹(shù)遺傳圖譜的可行性。Yamamoto等[26]利用巴梨×豐水的F1代群體，構(gòu)建了巴梨和豐水的遺傳連鎖圖譜。巴梨的遺傳連鎖圖譜由226個(gè)位點(diǎn)組成，其中有175個(gè)AFLP標(biāo)記、49個(gè)SSR位點(diǎn)；豐水的遺傳連鎖圖譜由154個(gè)位點(diǎn)組成，其中有106個(gè)AFLP標(biāo)記、42個(gè)SSR位點(diǎn)。2個(gè)圖譜之間可通過(guò)20個(gè)共顯性位點(diǎn)（19個(gè)SSR位點(diǎn)和1個(gè)自交不親和的S位點(diǎn)）部分連接，進(jìn)而找出二者之間的關(guān)系。Liebhard等[27]利用129個(gè)SSR標(biāo)記和其他的標(biāo)記構(gòu)建了目前飽和度最大的蘋(píng)果遺傳圖譜。

2.4 種質(zhì)資源保存和利用

SSR技術(shù)在園藝植物種質(zhì)資源上的研究比較廣泛，用以鑒定品種的真實(shí)性，防止混雜、外來(lái)花粉授粉及遺傳漂變。俞明亮等[28]對(duì)桃種間親緣關(guān)系進(jìn)行了SSR的鑒定，發(fā)現(xiàn)桃亞屬間普通桃與新疆桃的親緣關(guān)系最近，陜甘山桃與甘肅桃間也有較近的親緣關(guān)系。Carlos等[29]建立了優(yōu)化的SSR技術(shù)體系用于鑒定柑橘珠心苗。聚類(lèi)分析的結(jié)果與已知地理起源和譜系完全吻合，并且鑒別出兩個(gè)定錯(cuò)了名的種質(zhì)。這將對(duì)種質(zhì)資源的收集保存和利用發(fā)揮重要作用。

2.5 基因定位及分子標(biāo)記輔助育種

基因標(biāo)記是篩選與目的基因緊密連鎖的遺傳標(biāo)記，它是基因圖位克隆和分子輔助選擇育種的前提。Cevik 等[30]利用“Prima x Fiesta”產(chǎn)生的群體借助AFLP和SSR分離檢測(cè)到了3個(gè)新的抗蚜蟲(chóng)的基因位點(diǎn)，AFLP所得到的標(biāo)記與SSR標(biāo)記SdSSRa和2B12a僅相差1.3 cM，而且還表明Sd-1與Sd-2緊密連鎖，可能是等位基因。Patocchi等[31]通過(guò)SSR標(biāo)記（CH02C02a）發(fā)現(xiàn)了一個(gè)新的抗黑星病基因Vr2。Terakami等[32]定位了日本梨品種Kinchaku瘡痂病抗性基因Vnk，研究中，利用從梨和蘋(píng)果中獲得的SSR引物確定了瘡痂病抗性基因Vnk的圖譜位置，幾種DNA標(biāo)記技術(shù)（AFLP，RAPD）都能顯示所獲得的基因，測(cè)定了梨和蘋(píng)果瘡痂病抗性基因Vnk之間的關(guān)系。安靜等[33]應(yīng)用AFLP、RAPD和SSR標(biāo)記構(gòu)建了辣椒的分子遺傳連鎖圖譜，并進(jìn)行了辣椒抗疫病基因的QTL定位。他們構(gòu)建了辣椒分子遺傳連鎖圖譜，并進(jìn)行了辣椒抗疫病基因的QTL定位。辣椒分子遺傳連鎖圖譜包括12個(gè)連鎖群，70個(gè)標(biāo)記位點(diǎn)，其中AFLP標(biāo)記54個(gè)，RAPD標(biāo)記15個(gè)，SSR標(biāo)記1個(gè)，覆蓋長(zhǎng)度為429.02 cM，平均圖距為6.13 cM，連鎖群長(zhǎng)度為4.30～85.85 cM。在第4連鎖群上檢測(cè)到抗疫病基因的兩個(gè)QTL位點(diǎn)：一個(gè)QTL位點(diǎn)的LOD值為2.89，在連鎖群上的支持區(qū)域是0～7.2 cM，距離最近的標(biāo)記E 41M 53-7僅0.4 cM；另一個(gè)QTL位點(diǎn)的LOD值為 4.18，在連鎖群上的支持區(qū)域是13.6～35.6 cM，距離最近的標(biāo)記E 41M 52-6為7.0 cM，兩個(gè)QTL可解釋表型變異的貢獻(xiàn)率分別為9.5%和16.4%。王坤等[34]用分離群體分組分析法（BSA）和微衛(wèi)星多態(tài)性分析（SSR）技術(shù)對(duì)紅花蕓豆中的抗炭疽病基因進(jìn)行分子標(biāo)記鑒定，用Mapmaker3.0計(jì)算標(biāo)記與目的基因間的遺傳距離，發(fā)現(xiàn)B6連鎖群上的4個(gè)SSR標(biāo)記BM170、Clon1429、BMD37、Clon410 與 抗炭疽病基 因 Co-F2533連鎖，遺傳距離分別為6.6、18.4、20.9和30.9 cM，這些SSR標(biāo)記與Co-F2533基因在B6連鎖群上的排列順序?yàn)镃lon1429-Co-F2533-BM17-BMD37-Clon410。根據(jù)基因所在連鎖群的位置、抗病基因的基因庫(kù)來(lái)源可知，Co-F2533是一個(gè)新的來(lái)源于安第斯基因庫(kù)的抗炭疽病基因。

分子標(biāo)記用于輔助選擇育種可提高選擇的準(zhǔn)確性和效率，縮短育種年限。分子標(biāo)記輔助選擇是現(xiàn)代分子生物學(xué)與傳統(tǒng)育種學(xué)的結(jié)合，借助與目的基因緊密連鎖的分子標(biāo)記，對(duì)育種材料從DNA水平上進(jìn)行選擇，從而避免了依賴(lài)于表現(xiàn)性狀的表現(xiàn)間接推斷其基因型。Yan等[35]利用含有365個(gè)AFLP和SSR標(biāo)記的二倍體月季連鎖圖譜進(jìn)行了數(shù)量性狀定位，確定了3個(gè)與葉面積、2個(gè)與葉綠素含量相關(guān)的QTL位點(diǎn)，這將有助于月季生長(zhǎng)活力的分子輔助選擇。張桂粉等[36]采用SSR標(biāo)記和BSA法相結(jié)合的技術(shù)，找到了一個(gè)與桃熟性性狀基因緊密連鎖的分子標(biāo)記 P21 （5′→3′ATTCGGGTCGAACTCCCT，5′→3′ACGAGCACTAGAGTAACCCTCTC）。 Dalbo 等[37]曾對(duì)分子標(biāo)記在葡萄抗白粉病輔助選擇中進(jìn)行白粉病抗性選擇，可將感病個(gè)體范圍由原來(lái)的24%～52%降低為2%～18%，顯示了分子標(biāo)記輔助育種的優(yōu)越性。

3 展望

SSR標(biāo)記技術(shù)發(fā)展至今，已成為理想的分子標(biāo)記，SSR標(biāo)記在辣椒、番茄、甜菜、葡萄、蘋(píng)果等許多園藝植物親緣關(guān)系、遺傳多樣性、品種鑒定、遺傳圖譜構(gòu)建、種植資源的保護(hù)和利用、基因定位及分子標(biāo)記輔助育種等方面得到了極好的應(yīng)用。SSR標(biāo)記還在QTL分析、物種起源和進(jìn)化、品種改良及雜種優(yōu)勢(shì)預(yù)測(cè)中表現(xiàn)出巨大的應(yīng)用價(jià)值和優(yōu)勢(shì)，提高了育種效率。SSR獲得微衛(wèi)星DNA標(biāo)記一般需要建立、篩選基因組文庫(kù)，克隆測(cè)序，引物設(shè)計(jì)等一系列試驗(yàn)，人力、物力消耗巨大，開(kāi)發(fā)有一定的困難，費(fèi)用也較高；而且SSR標(biāo)記中所使用的引物不同，試驗(yàn)結(jié)果差異也大；PCR引物在不同物種間保守性較差，對(duì)于不同物種要進(jìn)行特異性引物設(shè)計(jì)，這就不利SSR標(biāo)記的發(fā)展。但微衛(wèi)星DNA仍然是研究當(dāng)前種內(nèi)遺傳變異中分辨率最高、揭示力最強(qiáng)的核DNA標(biāo)記。且SSR標(biāo)記引物一經(jīng)開(kāi)發(fā)出來(lái)，將一直受益，因此，需要加大SSR標(biāo)記引物的開(kāi)發(fā)。我國(guó)擁有豐富的園藝植物種質(zhì)資源，隨著SSR標(biāo)記技術(shù)不斷發(fā)展和完善，相信它將會(huì)推動(dòng)我國(guó)園藝植物遺傳育種研究進(jìn)入一個(gè)新的階段。

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