仔豬腸道微生態(tài)環(huán)境的調(diào)控

張文俊 賀建華

（湖南農(nóng)業(yè)大學動物營養(yǎng)研究所,長沙 410028）

動物腸道中棲息著約500種細菌,數(shù)量達到1.0×1014,這些微生物與胃腸道食糜及胃腸組織構成一個復雜多樣的菌群系統(tǒng),該系統(tǒng)即腸道微生態(tài)環(huán)境,對宿主的生長和健康有重大意義[1]。近年來,關于仔豬胃腸道菌群系統(tǒng)的研究日益受到人們的重視,因為對仔豬胃腸道菌群結構及其某些特殊種屬功能的研究將有助于尋求飼用抗生素的替代品[2]。此外,仔豬胃腸道菌群作為人類胃腸道菌群研究的模型,針對該模型的研究有助于了解胃腸道菌群對人類健康的影響。因此,本文就仔豬腸道微生態(tài)環(huán)境的生態(tài)學理論及腸道微生物區(qū)系的組成及變化、調(diào)控因素、研究方法及技術等研究進展進行了綜述。

1 仔豬腸道微生態(tài)環(huán)境

仔豬剛出生時,胃腸道是無菌的,從分娩到體外環(huán)境的幾個小時內(nèi),在胃腸道內(nèi)迅速形成了一個龐大的微生物群落。仔豬出生后24 h,空腸、回腸、盲腸和直腸分別定植了雙歧桿菌、大腸桿菌、乳酸桿菌、消化球菌、腸球菌、小梭菌、擬桿菌、真細菌和酵母菌[3],出生3 d仔豬腸道內(nèi)的微生物區(qū)系與母豬非常類似[4]。仔豬7日齡時發(fā)展出一個新的不同于母豬的微生物區(qū)系,同胎仔豬間的微生物區(qū)系仍類似,但與母豬已完全不同[4]。由于飼糧的改變,會降低微生物的發(fā)酵能力,再加上并欄,也會進一步改變豬體內(nèi)微生物的組成。一般來說,豬腸道內(nèi)微生物的代謝能力隨日齡的增加而降低。到8～22日齡時,雙歧桿菌、擬桿菌、乳酸桿菌、大腸桿菌和消化球菌成為優(yōu)勢菌。據(jù)報道,這些腸道菌群主要來源于母體。同時,細菌在消化道定植的順序,首先是需氧菌,然后是兼性厭氧菌,最后是專性厭氧菌[5]。

過去,通過傳統(tǒng)的微生物培養(yǎng)技術得知,健康成年豬的微生物區(qū)系相對成熟穩(wěn)定,糞樣和結腸中可培養(yǎng)細菌的具體組成和變化也比較清楚,而對仔豬微生物區(qū)系的組成和變化大多局限于乳酸桿菌和大腸桿菌[5]。趙桂英等[6]采用傳統(tǒng)的微生物培養(yǎng)技術對斷奶仔豬胃、十二指腸、盲腸、回腸、直腸內(nèi)容物中的細菌進行培養(yǎng),研究發(fā)現(xiàn)正常菌群有腸桿菌6.27×107,腸球菌4.70×107,葡萄球菌＜1.00× 104,雙歧桿菌4.53×109,乳酸桿菌1.60×108,鏈球菌2.30×106,韋榮氏球菌1.49×105,小梭菌1.76×108,其中有益菌群是雙歧桿菌、乳酸桿菌、類球菌、小梭菌,有害菌群是腸桿菌、韋榮氏球菌、葡萄球菌。由于傳統(tǒng)的微生物培養(yǎng)技術的局限性,Yao等[7]對42日齡健康仔豬的糞細菌區(qū)系中的優(yōu)勢菌用PCR/DGGE技術,進行16S rDNA序列分析,發(fā)現(xiàn)區(qū)系中絕大多數(shù)優(yōu)勢菌屬于未知或未培養(yǎng)的細菌,這些未知菌的最相似菌分屬于腸球菌、鏈球菌、梭菌、消化鏈球菌和乳酸桿菌,而未檢測到真桿菌、擬桿菌和普雷沃氏菌。姚文等[8]采用PCR/DGGE技術跟蹤新生仔豬腸道和糞樣細菌的演變,發(fā)現(xiàn)仔豬腸道微生物區(qū)系都是由出生時簡單到斷奶前復雜多樣,斷奶當天顯著變少,斷奶后較斷奶前明顯降低,而后微生物區(qū)系趨于多樣且穩(wěn)定。因此,斷奶前后腸道微生物區(qū)系迅速變化期間是調(diào)控仔豬腸道菌群的最佳時期。

2 仔豬腸道微生態(tài)環(huán)境的調(diào)控因素

由于仔豬尤其是從出生到斷奶前后的仔豬組織器官均發(fā)育不成熟,容易受到外界環(huán)境的影響,導致胃腸道菌群的失調(diào)。仔豬腸道微生物菌群失調(diào)主要是由于斷奶應激、氣候變化、飼料改變、病原微生物侵襲等原因引起[3]。仔豬的飼糧配方設計應主要圍繞仔豬腸道微生態(tài)環(huán)境的調(diào)控來進行,主要的調(diào)控措施是使用各類添加劑。

2.1 抗生素

關于飼用抗生素對腸道微生物的影響,大量試驗結果表明,飼用抗生素對動物腸道微生物呈現(xiàn)出抑制、促進或無影響等作用,報道結果變異很大,究其原因可能是由于不同的基礎飼糧、不同的取樣時間和部位以及不同的抗生素種類（抗菌譜不同）和添加水平造成的。雖然研究者提出飼用抗生素的促生長作用與腸道微生物的變化有關,但大多數(shù)試驗結果不足以解釋腸內(nèi)微生物隨畜禽生長的變化趨勢,飼用抗生素在畜禽不同生長階段是如何影響腸道菌群的,黏附在腸壁黏膜上的固有菌群是如何變化的,為何抗生素在畜禽幼齡階段起到促生長作用而在生長后期效果不明顯,這些均沒有得到很好的解釋[9]。姚浪群等[9]通過使用安普霉素研究其對仔豬腸道微生物及腸壁組織結構的影響,發(fā)現(xiàn)飼糧中添加安普霉素能明顯降低仔豬腹瀉發(fā)生率,對仔豬具有顯著促生長作用。飼糧中添加90 mg/kg安普霉素對斷奶后0～2、3～4周齡仔豬腸道（空腸、盲腸和結腸）中大腸桿菌的增殖均有明顯抑制作用,且顯著減輕小腸重量17.7%（P＜0.05）、縮短小腸長度13.7% （P＜0.05）,并使小腸絨毛排列規(guī)則、高度增加（P＜0.05）,絨毛高度與隱窩深度的比值增大。但由于抗生素在實際應用中帶來的一系列問題,如殘留、耐藥性、二重感染和降低機體免疫力等,其應用受到了很大的限制,研制安全性高的抗生素和抗生素的替代品已成為研究熱點[10]。

2.2 寡糖與多糖

寡糖是指2～10個單糖組成的一簇糖的總稱,多糖是多個單糖聚合而成的糖。寡糖和多糖是一類不能被動物消化酶所分解而能進入到動物腸道后段的物質,這些物質能夠被結腸的有益細菌選擇性發(fā)酵利用,最終有利于腸道的微生態(tài)平衡。比如單純的寡糖、植物提取物以及中草藥制劑,其主要有效成分都是寡糖或多糖。大量研究表明,甘露寡糖在動物體內(nèi)能夠促進腸道有益菌的增殖,減少腸道病原菌,提高腸道黏膜的完整性,調(diào)節(jié)動物免疫反應從而提高動物的生產(chǎn)性能[11]。Mathew等[12]研究表明, 0.5%的半乳甘露寡糖對斷奶仔豬大腸、回腸內(nèi)容物中大腸桿菌、乳酸桿菌和雙歧桿菌均無影響。侯振平等[13]報道,飼喂不同濃度的半乳甘露寡糖降低了斷奶仔豬回腸微生物種群數(shù)量,抑制了金色葡萄球菌、產(chǎn)氣莢膜等有害菌,促進部分乳酸桿菌、雙歧桿菌等有益菌的繁殖;在結腸中,降低了大腸桿菌數(shù),明顯提高了結腸中乳酸桿菌和雙歧桿菌數(shù)。張宏福等[14]報道,添加異麥芽低聚糖能有效抑制仔豬大腸桿菌的生長,同時能提高腸道中雙歧桿菌和乳酸桿菌等有益菌的數(shù)量。陳清華等[15]通過研究牛膝多糖對腸道微生物的影響表明,試牛膝多糖對腸道中大腸桿菌生長有抑制作用,而對腸道中乳酸菌和雙歧桿菌卻有明顯的增殖作用,且效果優(yōu)于抗生素。K leessen等[16]發(fā)現(xiàn)菊粉可顯著促進大腸中雙歧桿菌、乳酸桿菌等生長,使梭菌、擬桿菌、大腸桿菌等數(shù)量減少。尹富貴等[17]研究發(fā)現(xiàn)刺五加提取物可通過提高斷奶仔豬腸道乳酸菌增殖,增加乳酸的產(chǎn)量,降低腸道內(nèi)容物的pH,從而抑制大腸桿菌繁殖,增加腸道內(nèi)容物微生物的多樣性,提高機體免疫力和生長性能。然而,王秀武等[18]通過海洋寡聚糖對仔豬結腸腸道微生態(tài)的影響研究發(fā)現(xiàn),海洋寡聚糖對腸道微生物沒有顯著影響。綜上所述,寡糖及多糖是當前一大研究熱點,對仔豬腸道的調(diào)節(jié)通過對有益菌的增加和有害菌的抑制來提高機體免疫力從而改善生長性能。同時可知,并不是所有的寡糖對腸道微生物都有影響,不同種類糖的作用不同,有些糖促進有益菌的增殖,有些糖類沒有反應;有些糖在回腸中起作用,有些糖在結腸中起作用。由此說明腸道微生物對其種類和作用部位有選擇性,使得開發(fā)新原料也具有選擇性。

2.3 益生素

益生素主要是指通過改善腸道微生態(tài)平衡而對畜禽發(fā)揮有利作用的活的微生物制劑。在飼料中使用微生物添加劑的目的,即是保持胃腸道內(nèi)優(yōu)勢種群的穩(wěn)定性和整個胃腸道微生態(tài)環(huán)境的相對穩(wěn)定[19]。這方面報道比較多,技術也比較成熟。對于乳酸菌、酵母菌、芽孢桿菌等幾種菌種應用比較多,然而菌種的安全問題一直都是研究、生產(chǎn)和使用益生素關注的問題[3]。胡友軍等[20]研究活性酵母對早期斷奶仔豬腸道微生物區(qū)系的影響發(fā)現(xiàn)早期斷奶仔豬飼糧中添加耐熱性活性酵母能顯著降低腸道內(nèi)容物大腸埃希氏菌數(shù)和調(diào)節(jié)腸道微生物菌群平衡。張麗萍等[21]報道,豬源乳酸桿菌作為微生態(tài)制劑使用于15～45日齡的仔豬,在改善腸道微生態(tài)上效果明顯好于EM菌,以濃度為0.15%的豬源乳酸桿菌試驗組效果最好。

2.4 微量元素

多數(shù)研究者認為高銅有抗菌作用,可降低發(fā)病率。有研究表明高劑量銅能抑制腸道不良微生物菌群的生長,促進有益微生物菌群的生長,從而改變腸道微生物的結構。但由于高銅有環(huán)境污染的問題,因此高銅的安全飼喂量和抗菌作用的關系有待進一步研究[10]。有試驗發(fā)現(xiàn),飼糧中添加氧化鋅也有助于維持斷奶后仔豬腸道正常微生態(tài),但這種作用僅限于斷奶后前2周。高銅、氧化鋅抑菌作用的機理有待進一步研究。賈建英等[22]研究表明對母豬頭胎斷奶仔豬飼喂酵母硒,酵母硒作為有機硒通過母乳來提高仔豬腸道中的乳酸桿菌,降低大腸桿菌。究竟是酵母的作用,還是硒的作用,還是二者的共同作用,尚有待于進一步的研究。陳群等[23]報道,添加FeSO4對患腸炎仔豬,隨著鐵添加量的增加,仔豬小腸內(nèi)乳酸桿菌數(shù)略有減少,總菌中乳酸桿菌比例減小、大腸桿菌比例增大,大腸桿菌數(shù)相對乳酸桿菌數(shù)的比例也增大,大腸桿菌數(shù)和細菌總數(shù)都趨于增加,結果使結腸內(nèi)細菌,腸道微生物菌群失衡。

2.5 酸化劑

由于胃腸道內(nèi)乳酸桿菌等有益菌適宜在酸性環(huán)境中繁殖,而病原菌生長的適宜pH大多呈中性或偏堿性,因此酸化劑主要是通過降低胃腸道pH,從而抑制有害微生物繁殖,減少營養(yǎng)物質的消耗和抗生長毒素的產(chǎn)生,同時促進有益菌的增殖[24]。付建福[25]通過葡萄糖酸（GA）對斷奶仔豬腸道微生物區(qū)系和腸黏膜形態(tài)結構的影響研究發(fā)現(xiàn),豬的盲腸中的微生物可以發(fā)酵GA,GA可以調(diào)節(jié)盲腸微生物區(qū)系,增加短鏈脂肪酸產(chǎn)量和降低氨的濃度。李鵬等[26]通過對斷奶仔豬添加復合酸化劑研究發(fā)現(xiàn),添加酸化劑的各處理仔豬盲腸內(nèi)大腸桿菌和沙門氏菌的數(shù)量顯著低于沒有添加酸化劑的對照組,其中添加乳酸型酸化劑B的效果更明顯;添加酸化劑的處理的仔豬盲腸乳酸菌和雙歧桿菌的數(shù)量顯著高于對照組,其中添加乳酸型酸化劑B的效果更明顯。乳酸型酸化劑B的抑菌效果要優(yōu)于磷酸型酸化劑A,同類型酸化劑添加量越高抑菌效果越明顯。這可能是因為乳酸本身比其他有機酸具有更強的抑菌殺菌作用。但也有報道,有機酸對35日齡仔豬各段消化道內(nèi)大腸桿菌和乳酸桿菌無影響,這可能與35日齡仔豬胃腸道pH趨于相對穩(wěn)定和試驗飼糧組成有關。

2.6 酶制劑

由于在回腸末端吸收的營養(yǎng)物質對動物的意義遠大于在大腸中吸收的物質,因此大多數(shù)人都忽略了營養(yǎng)物質對小腸中腸道微生物的影響。越是難于消化的飼糧越有利于腸道微生物的繁殖,添加了相應的酶制劑越能明顯降低腸道微生物的數(shù)量。飼糧中添加酶所導致的腸道微生物的變化對動物營養(yǎng)的影響主要是間接的[27]。有研究表明,飼糧中添加木聚糖酶減少了腸道中利用淀粉和蛋白質的微生物數(shù)量,同時提高了利用木糖的微生物數(shù)量,說明外源酶分解所產(chǎn)生的糖對腸道原有的微生物發(fā)揮顯著的選擇壓力[28]。

3 腸道微生物研究的方法

從傳統(tǒng)上講,主要利用基于培養(yǎng)的技術對胃腸道細菌進行研究,該技術在實驗室廣泛使用且需要了解個體營養(yǎng)需要。但是可培養(yǎng)微生物仍然占少數(shù)[29],通過傳統(tǒng)的微生物培養(yǎng)技術,已知微生物區(qū)系相對成熟穩(wěn)定的健康成年豬糞樣和結腸中可培養(yǎng)細菌中約90%為厭氧革蘭氏陽性細菌,主要分屬鏈球菌屬、乳酸桿菌屬、梭桿菌屬、真桿菌屬和消化鏈球菌屬;約10%為厭氧革蘭氏陰性細菌,分屬擬桿菌屬和普雷沃氏屬,而對仔豬微生物區(qū)系的組成和變化大多局限于乳酸桿菌和大腸桿菌。由于傳統(tǒng)微生物技術的局限性,對豬腸道微生物區(qū)系缺乏較為真實的描述,特別是對仔豬出生后其腸道微生物區(qū)系的變化規(guī)律的研究非常薄弱[30]。近來,基于16S rRNA/rDNA基因的分子生物學技術的興起對依靠培養(yǎng)的技術進行了補充,以用來開發(fā)多種生態(tài)系統(tǒng)包括哺乳動物胃腸道的細菌群落的多樣性。這些技術能夠鑒定和定量小型生物群,而且也可提供分類法來預測種系發(fā)育關系。克隆文庫可以被測序,通常在種的水平上鑒定生物群的組成;指紋圖譜技術可以分析微生物群落結構,而斑點雜交技術或熒光原位雜交技術能夠測定特殊分類群的豐度。一些新興技術,如功能基因及其表達以及穩(wěn)定同位素和生物標記的聯(lián)合使用,正在發(fā)展和優(yōu)化,已用于研究個體或群體原位代謝活性。復雜微生物生態(tài)系統(tǒng)的核酸分離序列比較可以用于描述分子特性,同時也提供一個分類體系,可以預測自然進化關系[31]?；?6S rRNA的分子分析技術,包括變性梯度凝膠電泳（DGGE）、溫度梯度凝膠電泳（TGGE）、單鏈構象多態(tài)性（SSCP）、限制性片段長度多態(tài)性（RFLP）等腸道微生物研究工作中常用的分子生物學技術方法。此外,從傳統(tǒng)的培養(yǎng)到分子分析的過渡方法也逐漸得到應用。

4 小 結

隨著分子生物學技術的迅速應用,微生物區(qū)系的種類組成及其變化規(guī)律及作用機制逐漸被認識,微生物區(qū)的功能也會進一步揭示。從宏觀到微觀進一步深層次揭示腸道微生物的奧秘,更多的營養(yǎng)性的調(diào)控物有待開發(fā)和應用。

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（編輯 田艷明）