重金屬富集模式動(dòng)物粉正蚓Lumbricus rubellus的研究

李 維，吳文如，林小樺，喻良文，李 薇

(廣州中醫(yī)藥大學(xué)，廣東廣州 510006)

·方藥研究·

重金屬富集模式動(dòng)物粉正蚓Lumbricus rubellus的研究

李 維，吳文如，林小樺，喻良文，李 薇＊

(廣州中醫(yī)藥大學(xué)，廣東廣州 510006)

粉正蚓Lumbricus rubellus作為一種富集重金屬離子的模式動(dòng)物，是近年來國(guó)內(nèi)外學(xué)者研究重金屬富集機(jī)制及調(diào)控原理的重點(diǎn)關(guān)注對(duì)象。對(duì)粉正蚓重金屬富集相關(guān)的國(guó)內(nèi)外研究現(xiàn)狀進(jìn)行了系統(tǒng)地梳理和分析，同時(shí)還總結(jié)了重金屬富集研究的方法，并提出了今后研究的發(fā)展方向，以期為重金屬富集相關(guān)的研究提供可以借鑒的思路和方法。

粉正蚓;重金屬富集;金屬硫蛋白;重金屬響應(yīng)元件;應(yīng)用

粉正蚓Lumbricus rubellus為環(huán)節(jié)動(dòng)物門寡毛綱(Oligochaeta)動(dòng)物，原產(chǎn)于包括英國(guó)等國(guó)在內(nèi)的歐洲大陸，后經(jīng)殖民活動(dòng)傳播至美洲，現(xiàn)整個(gè)太平洋地區(qū)均有廣泛分布[1]。粉正蚓不僅因其藥食皆用而與民眾生活息息相關(guān)，同時(shí)也因其常生活于礦質(zhì)土中，通過不斷地縱橫鉆洞，掘穴松土、破碎、分解有機(jī)物和吞土排糞等生活習(xí)性，能高效地吸食和分解有機(jī)物質(zhì)、改良土壤，而成為土壤生物學(xué)和生態(tài)學(xué)的動(dòng)物研究模型[2]。特別是近年粉正蚓體內(nèi)能耐受蓄積高濃度的重金屬離子的現(xiàn)象被發(fā)現(xiàn)后，粉正蚓又成為國(guó)外學(xué)者關(guān)注的熱點(diǎn):一方面以粉正蚓為代表研究動(dòng)物體內(nèi)重金屬富集的機(jī)制;另一方面利用其進(jìn)行重金屬污染土壤的修復(fù)和改造。

筆者所在研究組在研究中藥地龍重金屬含量超標(biāo)時(shí)也發(fā)現(xiàn)地龍某些來源的原動(dòng)物，如參環(huán)毛蚓Pheretima aspergillum，具有與粉正蚓相似的重金屬富集特性，該結(jié)果將另文報(bào)道。考慮到參環(huán)毛蚓與粉正蚓的分類學(xué)上的親緣關(guān)系以及相似的生物學(xué)特性，本文著重對(duì)粉正蚓重金屬富集相關(guān)的國(guó)內(nèi)外研究概況進(jìn)行了系統(tǒng)地梳理和分析為本組進(jìn)一步研究地龍的重金屬富集機(jī)制尋求可供借鑒的思路和方法，同時(shí)也對(duì)其他類似研究工作提供參考依據(jù)。

1 粉正蚓重金屬富集特性的發(fā)現(xiàn)和確定

粉正蚓成蟲長(zhǎng)約60～140 mm，背赤紅有光澤而腹白，因此，國(guó)外有人稱其為“紅色蠕蟲”(Red Wriggler)。由于這種蚯蚓既可食用、也具備一定的臨床藥用價(jià)值，所以在與人類相關(guān)的食物鏈中扮演著重要的角色。然而，研究者們偶然發(fā)現(xiàn)了粉正蚓能夠生存在重金屬污染較嚴(yán)重的地區(qū)，并且能夠蓄積其進(jìn)食土壤中的重金屬元素，尤其是對(duì)鎘(Cd2+)和銅(Cu2+)具有較高的耐受能力，其Cd2+含量甚至可以達(dá)到干體重的1/1 000[3]，遠(yuǎn)高于其他類別的蚯蚓。粉正蚓的重金屬富集特性的發(fā)現(xiàn)，使其更加成為學(xué)者們的研究熱點(diǎn)。特別是在當(dāng)今關(guān)注環(huán)境的熱潮里，人們又把粉正蚓作為環(huán)境中重金屬污染程度的生態(tài)監(jiān)測(cè)指標(biāo)(Biomarker)[4]，并研究如何將粉正蚓用于改善生態(tài)土壤環(huán)境，使其成為清除土壤重金屬的工具[5]。

隨著研究不斷地深入，人們發(fā)現(xiàn)粉正蚓不僅能夠被動(dòng)地耐受鎘、銅、鉛、汞、鋅、鍶等各類金屬離子，而且還對(duì)某些重金屬離子存在著主動(dòng)富集的特性[6]。Stürzenbaum SR[7]考察了英國(guó) Rudry 地區(qū) (礦區(qū))粉正蚓與當(dāng)?shù)啬嗤林兄亟饘贊舛鹊南嚓P(guān)性，該地區(qū)土壤中分別含鉛(Pb)2337μg/g、鋅(Zn)5902μg/g、鎘(Cd)604μg/g(干重) ，粉正蚓體內(nèi)含鉛 (Pb)892μg/g，鋅(Zn)2 470μg/g，鎘(Cd)1 213μg/g(干重)。結(jié)果表明，鋅、鉛在粉正蚓體內(nèi)含量相應(yīng)地均比同重量泥土中的含量要低，而鎘在粉正蚓體內(nèi)含量則比土壤中含量高出一倍。由此可見，與鋅、鉛相比，粉正蚓對(duì)重金屬鎘存在著高濃度主動(dòng)蓄積的現(xiàn)象。

隨后，研究人員又對(duì)重金屬離子鎘在粉正蚓體內(nèi)的分布規(guī)律進(jìn)行了研究，并發(fā)現(xiàn)，鎘離子對(duì)重金屬的吸收主要集中在粉正蚓腸部上皮以及腸道皺褶，而黃色細(xì)胞囊組織則是重金屬鎘的最主要分布組織;在鈣腺及其囊泡中也發(fā)現(xiàn)有鎘的分布，但因分布較少，認(rèn)為可能不是鎘離子的主要排泄途徑，同時(shí)腎管部分也涉及到鎘離子的排泄，并且是一個(gè)會(huì)引發(fā)病理損害的主要靶點(diǎn)，而鎘離子在外部的表皮及縱肌組織中的分布則微乎其微[8]。

對(duì)于不同的金屬離子，來源于受不同程度重金屬污染土壤的粉正蚓種群存在著適應(yīng)性的差異。英國(guó)學(xué)者Edward F[9]采用了系統(tǒng)的非穩(wěn)態(tài)動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)對(duì)粉正蚓的重金屬富集特性進(jìn)行考察，非穩(wěn)態(tài)動(dòng)力學(xué)的研究包括了吸收實(shí)驗(yàn)(蚯蚓從未受污染的地區(qū)轉(zhuǎn)移至受污染地區(qū))和消除實(shí)驗(yàn)(蚯蚓從受污染地區(qū)轉(zhuǎn)移至未受污染地區(qū))，實(shí)驗(yàn)中把排泄時(shí)間作為一個(gè)重要變量，檢測(cè)不同時(shí)間里蚯蚓體內(nèi)的重金屬濃度。吸收實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，粉正蚓對(duì)鎘，銅，鉛，鎳和鋅的富集都在一定程度上依賴于土壤中的金屬濃度;而富集效率在含低濃度的重金屬土壤中更大。而消除實(shí)驗(yàn)則發(fā)現(xiàn)，粉正蚓在對(duì)重金屬排泄過程中保留了對(duì)鎘的蓄積，其體內(nèi)含量隨著排泄時(shí)間的增加反而不斷提高。目前對(duì)粉正蚓的非穩(wěn)態(tài)動(dòng)力學(xué)研究非常廣泛，改良方法也多樣。例如，Mari～no F[10]為了考察粉正蚓對(duì)不同棲息環(huán)境的適應(yīng)性，將分別來源于含鈣和含鍶豐富土壤的同類蚯蚓引進(jìn)至不受重金屬污染的土壤中飼養(yǎng)，經(jīng)消除實(shí)驗(yàn)后再交叉轉(zhuǎn)移至對(duì)方的棲息土壤中交叉飼養(yǎng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，源于含鍶地區(qū)的蚯蚓能夠富集更多的鈣。而又有學(xué)者在其基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)對(duì)粉正蚓種群及其后代對(duì)重金屬吸收程度的遺傳特性研究[11]，或者研究不同地區(qū)種群的粉正蚓對(duì)各類金屬離子的生物積累過程[12]?？傊?，各種實(shí)驗(yàn)均證實(shí):粉正蚓對(duì)鎘等重金屬有害元素具有顯著的耐受和富集作用。

2 粉正蚓重金屬富集機(jī)制的探索

粉正蚓能夠在體內(nèi)富集不同類型的重金屬離子，這一現(xiàn)象引發(fā)了人們對(duì)其重金屬富集機(jī)制的探索與研究。Stürzenbaum SR等[3]通過凝膠色譜技術(shù)對(duì)粉正蚓體內(nèi)具有與鎘緊密結(jié)合的蛋白質(zhì)進(jìn)行提取分離，然后進(jìn)行氨基酸末端序列分析，研究表明，粉正蚓種系中具有金屬響應(yīng)特性的蛋白具備其他種系動(dòng)物金屬硫蛋白的共同特征，是生物體金屬硫蛋白(Metallothioneins，MT)家族的一員。Morgan AJ等[13]通過收集重金屬污染嚴(yán)重的泥土中粉正蚓樣品，并使用針對(duì)金屬硫蛋白的多克隆抗體對(duì)粉正蚓進(jìn)行免疫染色實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)金屬硫蛋白主要存在于粉正蚓體內(nèi)的多孔結(jié)構(gòu)中，與形似于溶酶體的物質(zhì)共存。其分布主要在:腸表皮細(xì)胞的頂端細(xì)胞質(zhì)里;與腸相連的臨近的胞腔中;腎管的狹窄管狀區(qū)域以及鈣腺的上皮細(xì)胞分泌物中。從上述研究結(jié)果中發(fā)現(xiàn)，金屬硫蛋白的分布與重金屬離子的分布具有高度的相似性，這也印證了金屬離子在粉正蚓體內(nèi)是通過與金屬硫蛋白結(jié)合的方式進(jìn)行蓄積、分布以及代謝的。

現(xiàn)代研究表明，MT是一類廣泛存在于生物界的低分子量、富含半胱氨酸的金屬結(jié)合蛋白，具有參與機(jī)體微量元素儲(chǔ)存、運(yùn)輸和代謝、拮抗電離輻射、清除羥基自由基、重金屬解毒及參與激素和發(fā)育調(diào)節(jié)、增強(qiáng)機(jī)體應(yīng)激反應(yīng)等廣泛的生物學(xué)功能[14]。MT能結(jié)合汞、鎘、鉛等有毒重金屬離子，而且結(jié)合后就成為穩(wěn)定的MT的一部分，從而使其失去對(duì)細(xì)胞的毒害作用。為驗(yàn)證粉正蚓對(duì)鎘金屬離子的高度特異富集特性，Thanh T等[15]開展了對(duì)其金屬硫蛋白具體結(jié)合的研究，通過紫外吸收、圓二色譜和電噴霧電離質(zhì)譜pH滴定實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，20個(gè)半胱氨酸(Cys)的MT-2能夠與和7個(gè)Cd2+結(jié)合，而20個(gè)半胱氨酸分裂成了兩個(gè)分離的序列區(qū)域，其中11個(gè) Cys在N氨基末端，9個(gè)Cys在C氨基末端。因此，鎘離子與MT-2的結(jié)合方式可以推斷為Cd3Cys9和Cd4Cys11。實(shí)驗(yàn)顯示了粉正蚓MT與已知的其他的MT存在顯著的差異，也證實(shí)了粉正蚓的MT-2對(duì)鎘具有較大差異的“肽結(jié)合域”。

隨著分子生物技術(shù)的發(fā)展，人們?cè)絹碓蕉嗟匕蜒芯磕抗夥旁诹嘶蜣D(zhuǎn)錄水平方面?，F(xiàn)代研究對(duì)生物體代謝重金屬的基因調(diào)控模式研究主要集中在“谷胱苷肽再生說”以及“金屬硫蛋白合成說”，前者是使已與金屬結(jié)合過的谷胱苷肽迅速恢復(fù)其結(jié)合能力;而后者是通過上調(diào)wMTs編碼基因，誘導(dǎo)性產(chǎn)生大量的能與重金屬離子結(jié)合的MT[16]。“金屬硫蛋白合成說”無疑更符合人們對(duì)粉正蚓重金屬代謝模式的猜想。英國(guó)學(xué)者S.R.Stürzenbaum率先在粉正蚓的腸上皮和胚胎等組織成功分離出了3個(gè)隨重金屬濃度誘導(dǎo)性上調(diào)的wMTs編碼基因:wMT-1、wMT-2和wMT-3[3]，從而再次在基因?qū)用鏋樽C實(shí)粉正蚓在重金屬富集方面采用金屬硫蛋白途徑的生物調(diào)控模式提供了確切的證據(jù)。

現(xiàn)代科學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，重金屬對(duì)wMTs基因的誘導(dǎo)表達(dá)是一個(gè)嚴(yán)密而復(fù)雜的過程，它與MT基因功能區(qū)的調(diào)控作用有著緊密的聯(lián)系?；蛘T導(dǎo)表達(dá)的一般過程為:生物體內(nèi)預(yù)先存在一種或多種金屬效應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子 (Metal-responsive Transcription Factors，MTFs) ，當(dāng)其與金屬離子結(jié)合后便誘導(dǎo)產(chǎn)生變構(gòu)，進(jìn)而與生物體內(nèi)普遍存在的金屬應(yīng)答元件MREs(Metal Responsive Elemen)[17]結(jié)合，對(duì)效應(yīng)基因進(jìn)行調(diào)控，促發(fā)MT的mRNA轉(zhuǎn)錄。而在MTs基因啟動(dòng)子部分的多個(gè)調(diào)控部件中，MREs是唯一的能與金屬調(diào)節(jié)蛋白轉(zhuǎn)錄因子(MTF)靶向結(jié)合的基因調(diào)控元件[18]，而且是已知調(diào)控元件中最具特異性的介導(dǎo)重金屬對(duì)MT基因轉(zhuǎn)錄誘導(dǎo)的順式作用元件，是金屬元素控制基因轉(zhuǎn)錄的重要位點(diǎn)。

因此，研究MREs表達(dá)調(diào)控的過程及其分子調(diào)控機(jī)制，同時(shí)研究參與MT表達(dá)調(diào)控的各類因子，對(duì)其各自的作用進(jìn)行分析比較，進(jìn)一步尋找相應(yīng)的反式調(diào)控因子，為實(shí)現(xiàn)在基因?qū)用婵刂破鋵?duì)重金屬離子的富集或者加速其排泄尋求可能性，這對(duì)于本團(tuán)隊(duì)研究在源頭上解決地龍藥材重金屬超標(biāo)問題提供了重要的借鑒。

3 粉正蚓研究的應(yīng)用前景

粉正蚓的基因研究成果能夠?yàn)槲覀冊(cè)谧鲞M(jìn)一步研究以及對(duì)相關(guān)物種開展研究提供高效的參照平臺(tái)。第7屆國(guó)際蚯蚓生態(tài)學(xué)座談會(huì)在粉正蚓基因研究信息普及共享方面作出了突出的貢獻(xiàn)。會(huì)議論述了EST(Expressed Sequence Tag，表達(dá)序列標(biāo)簽，指一排從cDNA互補(bǔ)文庫中隨機(jī)產(chǎn)生并且提供一種方法能用于獲取大量編碼cDNA序列信息的簡(jiǎn)短的單一的可閱讀序列)工程的進(jìn)展，并對(duì)蚯蚓EST工程進(jìn)展進(jìn)行了一個(gè)簡(jiǎn)要的概括:蚯蚓 EST工程發(fā)展非常迅速，對(duì)粉正蚓基因始端577個(gè)排序的分析能夠?qū)?yīng)大約400種不同的基因，其中79種可以由兩個(gè)或多個(gè)EST來表述。已知蛋白具有顯著序列相似性而被發(fā)現(xiàn)的有76%，剩余的24%被歸類為新基因[19]。英國(guó)學(xué)者S.R.Stürzenbaum通過使用生物信息學(xué)工具，建造了一個(gè)蚯蚓序列信息的關(guān)系數(shù)據(jù)庫-LumbriBASE，通過互聯(lián)網(wǎng)界面(http://www.earthworms.org)，所有相關(guān)研究者均可以進(jìn)行關(guān)鍵詞搜索和序列相似性比對(duì)，對(duì)于重金屬富集動(dòng)物的相關(guān)研究起到了巨大推動(dòng)作用。

21世紀(jì)人類的生產(chǎn)活動(dòng)和全球工業(yè)化進(jìn)程的加劇，世界許多國(guó)家和地區(qū)的空氣、土壤及水體面臨著越來越嚴(yán)重的重金屬污染的危害，重金屬在土壤中產(chǎn)生的污染具有隱蔽性、長(zhǎng)期性和不可逆性等特點(diǎn)[20]，不但會(huì)嚴(yán)重影響動(dòng)植物的產(chǎn)量與品質(zhì)，更重要的是通過食物鏈或藥物危害人類的生命和健康。因此與土壤或水域相關(guān)的動(dòng)植物系統(tǒng)中的重金屬污染成為評(píng)價(jià)動(dòng)植物品質(zhì)的重要指標(biāo)，由于粉正蚓的普遍存在以及其重金屬富集特性，使它成為了世界上許多發(fā)達(dá)國(guó)家的生物研究、生態(tài)環(huán)境研究的動(dòng)物研究模型[21]。近年有報(bào)道科學(xué)家在英國(guó)一處廢棄的礦井發(fā)現(xiàn)了變異的蚯蚓，這種蚯蚓能在被嚴(yán)重污染的有毒土壤環(huán)境中生存下來，并吃掉這些污染土壤的重金屬[22]。因而有科學(xué)家也開始研究粉正蚓的基因變異調(diào)節(jié)，從而

考慮把其可作為改善重金屬生態(tài)污染的重要解決手段[23]。而隨著藥學(xué)研究在利用蚯蚓提取物蚓激酶[24]、纖溶酶[25]等用于治療心臟病、腫瘤等常見疾病方面的發(fā)展，國(guó)內(nèi)外對(duì)蚯蚓的應(yīng)用也提升到一個(gè)新的平臺(tái)。解決食物鏈中的重金屬轉(zhuǎn)移，解決生態(tài)環(huán)境問題，解決臨床藥用安全等一切與人類生存密切相關(guān)的問題，都要求著我們對(duì)蚯蚓作出更深入和更全面的研究。

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R284.3

A

1007-4813(2010)05-0762-04

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(No.30772741)，廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目(No.2007B020701004和No.2009B06070006)。

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李 薇，教授。E-mail:liwei-li@163.com.cn

2010-5-04)