脊髓損傷的細胞療法進展

劉明永,趙建華,王愛民

(第三軍醫(yī)大學大坪醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所骨科,重慶 400042)

脊髓損傷(SCI)發(fā)病率較高,并具有高致殘率、低死亡率的特點。據(jù)美國脊髓損傷信息網統(tǒng)計,美國現(xiàn)有嚴重神經功能障礙的 SCI患者約 253 000人,并以每年約 11 000人的速度增加,平均發(fā)病年齡為 38歲[1]。SCI嚴重影響患者的生活質量,并給患者家庭及社會帶來沉重的經濟負擔,因此 SCI一直是基礎及臨床研究的熱點。

脊髓損傷必然導致細胞死亡。雖然成年脊髓含有內源性神經干/祖細胞(NSPCs),但是受到其自身再生能力及局部抑制性微環(huán)境的影響,難以形成有效的細胞再生,對神經功能恢復的作用有限。因此,尋找合適的細胞及策略,替代SCI后死亡的功能細胞,從而促進神經功能恢復就成為研究的重點之一。近年來,以干細胞為代表的細胞替代研究在SCI領域取得一定進展,為 SCI治療帶來曙光。本文就近年來 SCI領域的細胞療法進展做一綜述。

1 干細胞移植

1.1 人胚胎干細胞(hESCs) 1998年,Thomson等[2]首先發(fā)現(xiàn) hESCs具有向各種體細胞分化的多向分化潛能并受到高度關注。Vadivelu等[3]通過腦的興奮性毒性損傷模型證實,移植的 hESCs可以表達血管內皮細胞、膠質細胞及不同神經元亞型的免疫標記物,并能夠形成形態(tài)正常的突觸。Nayak等[4]也證實胚胎干細胞(hESCs)可以在肌萎縮性側索硬化實驗模型中形成功能性的運動神經元,為 ESCs在 SCI中的應用提供了新的實驗依據(jù)。

雖然理論上hESCs可以分化為任何一種體細胞,并可能治愈多種疾病,但是獲取 hESCs需要破壞人類胚胎,由此引起的倫理學和法律問題始終困撓著 hESCs研究。Klimanskaya等[5]成功地利用桑椹胚期的單個卵裂細胞培育出hESCs,在理論上規(guī)避了困擾 hESCs研究的倫理學問題。但是 hESCs的研究仍面臨諸多問題。首先,hESCs可能誘發(fā)免疫排斥反應。研究顯示,雖然未分化的 hESCs低表達人白細胞抗原-Ⅰ(HLA-Ⅰ),而不表達人白細胞抗原-Ⅱ (HLA-Ⅱ),可能能夠逃避宿主的排斥反應,但是完全分化的 hESCs是否仍能逃避宿主的免疫排斥反應尚不得而知。其次,hESCs可能具有潛在致瘤性。hESCs具有癌細胞的某些特征,如基因不穩(wěn),缺乏自限性,DNA修復活性增強等,由此導致的潛在的致瘤性限制了 hESCs的應用。近來有研究顯示,通過分子生物學及細胞篩選技術,能夠在體外通過 hESCs分化、培養(yǎng)成熟膠質細胞,并能夠在 SCI后是損傷軸突再髓鞘化[6]。但是hESCs的潛在致瘤性始終是其研究的局限之一。近來,Yu等[7]通過病毒基因轉移,從成年體細胞逆向分化成功了具有供體免疫學特征的多能細胞,該多能細胞和ESCs相似,具有向多種細胞分化的潛能。該發(fā)現(xiàn)為規(guī)避ESCs研究的倫理學限制及免疫匹配提供了可能。但是此種細胞攜帶有病毒基因,當其整合到宿主DNA后是否會導致突變尚需進一步研究。

1.2 胎兒干細胞 使用胎兒組織移植治療中樞神經系統(tǒng)(CNS)和帕金森病的報道最早見 20世紀 70年代。最近有報道胎兒來源的神經祖細胞(NPCs)能分化為神經元和少突膠質細胞,在移植后能夠促進SCI神經功能恢復[8]。由于來源有限,胎兒干細胞的研究受到極大限制。

隨著臍血庫的完善,胎兒干細胞的來源有所增加。先后有學者使用臍血制備干細胞,并用于促進SCI后軸突的再髓鞘化、增加神經營養(yǎng)作用[9]。但是,臍血干細胞的特性,其促進 SCI神經功能恢復程度及其機制仍需大量實驗驗證。

1.3 成體神經干/祖細胞(aNSPCs) 目前研究發(fā)現(xiàn),在腦和脊髓均存在 aNSPCs。此類細胞具有很強的自我更新和向其來源組織的所有細胞成分分化的能力。但是實驗也發(fā)現(xiàn)此類細胞在異位移植入其他組織(如脊髓)后存在轉分化的可能性。但是 aNSPCs規(guī)避了困擾 ESCs和胎兒干細胞再生研究的倫理學和法律問題,所以對其研究報道較多。諸多研究證實,aNSPCs可以促進 SCI后神經再生、少突膠質細胞再髓鞘化等病理過程,從而促進神經功能恢復[10]。

近來,Eftekharpour等[11]使用綠色螢光標記的 aNSPCs修復大鼠鉗夾傷 SCI模型取得了一定效果。該實驗中使用的成體 NPCs來源于大鼠腦室下區(qū),培育體系中含 1%的神經干細胞(NSCs)和 99%的成體 NPCs。為了模擬臨床常見的亞急性和慢性 SCI,作者分別于損傷后 2周和 8周移植細胞。結果顯示,在亞急性期 NPCs的存活率約 40%,其分布主要局限于脊髓白質,但是主要分化為膠質細胞,可能和脊髓局部微環(huán)境利于膠質細胞分化有關。在慢性期移植后成體NPCs很難存活。這可能和脊髓局部抑制性的微環(huán)境及神經營養(yǎng)性因素不足有關[12]。另外,干細胞移植的數(shù)量、時機同樣重要。研究顯示,SCI后第 1周內,損傷局部免疫反應強烈而不利于干細胞存活,而第 2周移植效果較佳;較為合適的干細胞數(shù)量為 1×106個[13]。

1.4 間充質干細胞(MSCs) MSCs來源于胚胎中胚層并保持了干細胞核心的自我更新和向不同結締組織細胞分化的多向分化潛能。MSCs已被用于 SCI模型的實驗研究,但是MSCs能否分化為神經細胞仍存在爭論。Phinney等[14]綜述發(fā)現(xiàn)有研究證實 MSCs在體內能夠表達巢蛋白(nestin)和成纖維細胞酸性蛋白(GFAP),并在特定的培養(yǎng)環(huán)境中呈神經元樣的形態(tài),從而認為MSCs能夠轉分化為神經細胞。然而,nestin和GFAP并非是神經組織所特有的標記物,在中胚層來源的其他組織,如肌肉和軟骨組織中也有表達。而形態(tài)的相似可能是源于特定培養(yǎng)基的假陽性,而不能得到神經元特定的功能檢測,如神經電生理學的支持,所以MSCs是否能夠轉分化為神經細胞尚需進一步研究,而 MSCs移植促進 CNS損傷功能恢復可能是源于其分泌生長因子或調控局部免疫反應的能力。Lu等[15]使用攜帶神經營養(yǎng)因子基因的骨髓來源 MSCs移植于慢性SCI大鼠,發(fā)現(xiàn)MSCs可以促進軸突再生并通過膠質瘢痕,但是實驗未觀察到神經功能恢復,顯示再生的軸突未能和宿主組織形成有效的突觸聯(lián)系;還有研究顯示,MSCs促進神經功能恢復的作用可能來自于神經保護途徑,如抑制Fas介導的神經細胞凋亡。

2 雪旺細胞和嗅鞘細胞(OECs)

雪旺細胞是周圍神經系統(tǒng)髓鞘的構成細胞,在采用再髓鞘化策略治療 CNS疾病時常作為替代細胞。由于雪旺細胞易于臨床制備,雖然存在導致神經鞘炎的風險(和硫酸軟骨素蛋白多糖形成增加有關),并可能加重神經痛的發(fā)生,但是研究內源性 OECs在SCI局部的浸潤、分布及對髓鞘形成的影響的文章仍較多。

在周圍神經系統(tǒng)損傷后,雪旺細胞通過分泌神經營養(yǎng)因子和細胞外基質成分為軸突再生提供良性環(huán)境,并最終實現(xiàn)軸突的再髓鞘化。有研究顯示,移植雪旺細胞至 SCI局部后,雪旺細胞能夠和宿主組織整合,實現(xiàn)感覺神經軸突的再生和軸突的髓鞘化,并促進動物后肢功能的輕度改善。研究也發(fā)現(xiàn),雖然內源性雪旺細胞能夠存在于脊髓空洞內,但是存活率很低[16];而來源于皮膚的雪旺細胞雖然可以在脊髓空洞內存活,誘導軸突再生和髓鞘化,但是這些軸突的分布規(guī)律及其功能尚需進一步研究。OECs表型特征和雪旺細胞相近,聯(lián)合移植能夠強化雪旺細胞的治療作用。有學者認為OECs不僅和軸突再生有關,而且和 SCI后再髓鞘化或脫髓鞘疾病有關,相反的結論也有報道[16]。出現(xiàn)矛盾性結果的原因可能和供體年齡及細胞分離的方法不同有關。OECs和雪旺細胞均表達神經營養(yǎng)素受體(p75),而后者經常用于OECs的純化,所以雪旺細胞對 OECs的沾染或許能部分解釋所觀察到的 OECs在軸突髓鞘化方面的矛盾性結果,而電鏡觀察也證實 OECs是軸突再生的主要支持細胞,為內源性雪旺細胞形成髓鞘提供結構性骨架。

3 免疫細胞

傳統(tǒng)的理論認為,免疫反應導致SCI的繼發(fā)性損傷,CNS有害或者參與繼發(fā)性損傷。但是,越來越多的證據(jù)顯示,適度的免疫反應為SCI治療所必須,并具有重要的神經保護作用。1990年,David等[17]研究發(fā)現(xiàn),巨噬細胞和小膠質細胞介導的免疫反應可以促進軸突的再生,部分逆轉哺乳動物CNS損傷的不可逆狀態(tài)。而研究亦證實,SCI后的保護性免疫反應主要是由 T細胞介導的細胞免疫[18]。Schwart等[19]進一步研究證實,導致自身免疫性疾病、具有神經保護作用的為 Th-1細胞(T helper 1 cell)。Yoles等[20]的研究證實CNS損傷后,自然發(fā)生的 CD 4+CD 25+調節(jié)性 T細胞(Treg)抑制了保護性 T細胞介導的免疫反應。而通過過度表達髓磷脂堿性蛋白(MBP)反應性 T細胞受體的轉基因小鼠的研究,顯示在視神經損傷(ONI)小鼠,視神經節(jié)細胞的存活率較野生型小鼠高。而 Jones等[21]利用相同的轉基因小鼠所做的研究卻顯示出相反的結果。在該實驗中,轉基因小鼠中＞95%的 CD4+T細胞為針對 MBP的 T細胞。結果顯示,轉基因小鼠的后肢負重能力明顯弱于野生型小鼠,而軸突脫髓鞘、損傷范圍亦重于野生型小鼠。實驗還證實,SCI后,轉基因小鼠的周圍淋巴組織的細胞因子增加以 Th-1細胞分泌的白細胞介素-2(IL-2)、干擾素-γ(IFN-γ)為主,而分泌 IL-4、IL-5的Th-2細胞亦增加;而 IL-10的分泌卻減少。后者是一種 SCI的潛在性保護因子。上述實驗的矛盾性結果,顯示了 SCI后免疫反應的復雜性。表明局部免疫必須處于嚴格的調控之下,才能對SCI起到治療作用。

由于 Th1、Th2、Treg等功能性淋巴細胞的活化、分化均與樹突狀細胞(DCs)的調控有關,故 DCs在 SCI中的作用近來逐漸受到重視。DCs是專職抗原呈遞細胞,在SCI的免疫反應中起到重要的調控作用。Schwartz等[22]所在的研究團隊發(fā)現(xiàn) DCs移植后可增加神經營養(yǎng)蛋白-3(NT-3)、IL-2等保護性細胞因子的表達,促進損傷的 SCI功能恢復,將其用于臨床實驗,取得較好的效果,由此提示DCs調節(jié)的免疫反應在 SCI修復中具有重要的神經保護作用。Hauben等[23]證實:在大鼠 SCI后,通過損傷局部或給予負載髓鞘堿性蛋白的樹突細胞(mbpDCs),均可顯著促進大鼠神經功能恢復,改善神經組織病理狀態(tài),而較單純 DCs效果更佳。Mikam i等[24]證實:DCs在體外可以增加 NSPCs的存活和分化;在共同移植后,能夠活化內源性 NSPCs啟動神經再生,并分泌NT-3,活化小膠質細胞,從而促進小鼠 SCI功能恢復。Liu等[25]研究發(fā)現(xiàn)使用負載脊髓勻漿蛋白的樹突狀細胞(hp-DCs)修復 BALB/c品系(BALB/c)小鼠脊髓損傷,實驗觀察84天,結果顯示hpDCs可以顯著促進小鼠脊髓損傷神經功能恢復,增加體內nestin表達,降低 GFAP表達,降低斑痕厚度,縮小脊髓空洞。上述研究均證實免疫細胞在SCI的修復中起到重要作用。

4 結論

以干細胞、免疫細胞為代表的細胞移植治療SCI取得了一定進展,其中,神經干細胞能夠分化為神經細胞,修補組織缺損,提供營養(yǎng)支持,并可能在良好調控的條件下構建新的突觸聯(lián)系。因此,干細胞療法或可為脊髓損傷的治療帶來曙光并可能取得突破。目前細胞療法治療 SCI的主要目標是:(1)促進神經元再生;(2)促進再髓鞘化;(3)提供營養(yǎng)分子促進細胞保護;(4)調控局部免疫反應。其終極目標是增加內源性 NSCs的潛能。但是損傷后活化的內源性成體NPCs作用有限,難以有效彌補損傷的細胞,最終的解決之道可能在于采用多種聯(lián)合的治療策略,包括減少膠質瘢痕、清除抑制分子、免疫調控及組織工程支架橋接損傷區(qū)等。而如何在損傷脊髓組織營造一種有利于干細胞存活并向神經元分化的微環(huán)境,如何調控免疫干預的時效性可能是未來研究的主要方向。

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