冬凌草甲素對 HL-60細胞 p53表達及細胞周期的影響

趙國英 趙銘鋒 郭金將 張海鴻 王 暉

1濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院兒科 濱州市 256603;2濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院病理科

冬凌草甲素對 HL-60細胞 p53表達及細胞周期的影響

趙國英1趙銘鋒2郭金將1張海鴻1王 暉1

1濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院兒科 濱州市 256603;2濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院病理科

目的 探討冬凌草甲素對HL-60細胞p 53表達及細胞周期的影響。方法 通過PI染色,流式細胞儀檢測細胞周期和凋亡峰,并以 RT-PCR檢測p53基因的表達。結(jié)果 流式細胞儀分析顯示,冬凌草甲素處理后使細胞周期發(fā)生變化:G1期、S期細胞的比例減少,G2/M期細胞的比例增加,凋亡的細胞數(shù)比例增多,且隨著藥物濃度的增加而逐漸增加。RT-PCR檢測結(jié)果顯示,20μmol/L冬凌草甲素作用后,與對照組相比,HL-60細胞 p53 mRNA水平顯著升高,且隨時間延長表現(xiàn)得更為明顯。結(jié)論 冬凌草甲素能使細胞周期發(fā)生變化和p 53基因的上調(diào),從而誘導(dǎo)細胞發(fā)生凋亡。

HL-60細胞;冬凌草甲素;細胞周期;p 53

白血病是兒童最常見的惡性腫瘤,近年來其療效有很大提高,但仍有部分患兒對化療不敏感和耐藥,尋找新型治療白血病的藥物成為臨床研究熱點之一。研究證明,冬凌草甲素具有廣泛的抗腫瘤作用,并對白血病細胞生長具有明顯抑制作用[1～3],但其誘導(dǎo)白血病細胞凋亡的相關(guān)機制目前尚未明確。研究冬凌草甲素對白血病細胞的細胞周期變化及其對 p53基因表達的影響,對進一步探索冬凌草甲素促進白血病細胞凋亡相關(guān)機制具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 人白血病細胞株 HL-60細胞為山東大學(xué)血液病中心實驗室凍存。冬凌草甲素 (Oridonin)購自上海卓康生物科技有限公司,規(guī)格 20 mg/支(C≥98%);RPMI-1640為美國 Hyclone公司產(chǎn)品;小牛血清為杭州四季青生物制品廠產(chǎn)品;二甲基亞砜(DMSO)、四甲基偶氮唑藍(MTT)為 AMRESCO產(chǎn)品;膜聯(lián)蛋白 V(Annexin V)凋亡檢測試劑盒購于 Biovision公司,coll細胞分離液、磷酸鹽(PBS)緩沖液 、PI(碘化丙啶)、Hoechst染液為 Sigma公司產(chǎn)品。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養(yǎng):HL-60細胞株復(fù)蘇后懸浮生長于 RPMI-1640培養(yǎng)液中,內(nèi)含 10%小牛血清,1 mmol/L谷胺酰胺及青鏈霉素各 100 U/L。于 37℃、5%CO2的飽和濕度孵箱中培養(yǎng),每 2～3 d傳代 1次,取對數(shù)生長期的細胞接種于含不同濃度冬凌草甲素的培養(yǎng)體系中進行實驗,將細胞終濃度調(diào)至 2×105/L。

1.2.2 細胞形態(tài)學(xué)觀察:收集經(jīng)不同濃度(5、10、15、20、25μmol/L)的冬凌草甲素分別誘導(dǎo)處理 24、48和 72 h的 HL-60細胞,離心洗滌,制成細胞涂片,干燥后瑞氏-姬姆薩染色,光學(xué)顯微鏡下觀察細胞形態(tài)。觀察細胞處理后細胞膜細胞質(zhì)及細胞核的變化,尤其觀察凋亡小體形成等。

1.2.3 細胞周期檢測:收集不同濃度冬凌草甲素作用 72 h后的 HL-60細胞,70%冷乙醇固定過夜,PBS清洗,200μl RNaseA 37℃水浴消化 30min,800μl PI避光染色 30 min,上流式細胞儀進行細胞周期和凋亡峰檢測。未加藥組為對照組。

1.2.4 RT-PCR檢測 P53基因 mRNA的表達:收集對照組和藥物作用組 (冬凌草甲素 20μmol/L作用48 h)細胞,Trizol裂解(GIBCO公司)提取細胞總RNA,特定蛋白分析儀測定 RNA純度(A260/A280＞1.75)。加入隨機引物及 M-MuLV逆轉(zhuǎn)錄酶(MBI,FERMENTAS)合成 cDNA鏈。取 cDNA0.1 μg,加入 10×Bu ffer 2.5μl,25 mmol/LMgCl21μl,10 mmol/L dNTP 0.5 μl,20 pmol/μl的上下游引物各 0.5 μl,TaqDAN聚合酶 (Promega,5 u/μl)0.5 μl,滅菌雙蒸水將反應(yīng)體系補足至 25μl。ThermoPX2型 PCR儀進行擴增,以 β-actin作為內(nèi)參照。

p53反應(yīng)條件為:預(yù)變性 95℃ 2 min;變性 94℃45 s,退火 51.9℃ 1min,延伸 72℃ 90 s;最后延伸10 min,共 35個循環(huán)。β-actin反應(yīng)條件為:預(yù)變性95℃ 2 min;變性 94℃ 45 s,退火 58℃ 1 min,延伸72℃ 1min;最后延伸 10min,共 35個循環(huán)。各引物序列分別為:p53上游引物為 :5'-TCTGGGACAGCCAAGTCTGT-3',下游引物為 5'-GGAGTCTTCCAGTGTGATGA-3',擴增產(chǎn)物為 435 bp;β-actin上游引物為:5'-CGCTGCGCTG-GTCGTCGACA-3',下游引物為5'-GTCACGCAC-GATTTCCCGCT-3',擴增產(chǎn)物為 619 bp。

擴增產(chǎn)物行 1.7%瓊脂糖凝膠電泳,于 BIORAD Gel 2000凝膠成像儀上成像 Quantity One軟件作半定量分析。

1.2.5 統(tǒng)計學(xué)分析:所得數(shù)據(jù)經(jīng) SPSS 10.0 forwindows軟件處理,結(jié)果用±s表示。數(shù)據(jù)用方差分析和 Dunnett檢驗進行統(tǒng)計學(xué)分析,P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 細胞形態(tài)學(xué)變化 空白對照組的 HL-60細胞光鏡下細胞呈圓形,胞核居中占整個細胞絕大部分,染色質(zhì)呈紫紅色,胞漿量少;5μmol/L的冬凌草甲素處理的細胞形態(tài)學(xué)改變不明顯;10μmol/L及其以上濃度的冬凌草甲素處理的 HL-60細胞形態(tài)有明顯改變,甚至出現(xiàn)凋亡小體。以 20μmol/L的冬凌草甲素處理細胞 48 h后,大部分細胞出現(xiàn)凋亡的形態(tài)學(xué)變化。表現(xiàn)為:細胞皺縮、體積縮小,多數(shù)細胞染色質(zhì)濃集、細胞核固縮,細胞內(nèi)出現(xiàn)典型的凋亡小體,表現(xiàn)出現(xiàn)特異性的凋亡形態(tài),見圖 1、2。

圖1 經(jīng) 20μmol/L的冬凌草甲素處理 48 h的 HL-60細胞光鏡下形態(tài)學(xué)改變 (W right-Giemsa染色,×1000)

圖2 未經(jīng)冬凌草甲素處理的HL-60細胞光鏡下形態(tài)(Wright-Giemsa染色,×1000)

2.2 冬凌草甲素對 HL-60細胞周期的影響 冬凌草甲素處理后在細胞周期 G1峰前出現(xiàn)亞二倍體峰,即亞 G1期峰(凋亡峰),該期細胞數(shù)占檢測細胞的百分比,即為細胞發(fā)生凋亡的比例。亞G1期峰隨著藥物濃度的增加而逐漸明顯,10～25μmol/L的冬凌草甲素各組凋亡率分別為(4.6±0.48)%,(13.7±1.8)%,(25.7±1.46)%,(32.1±1.63)%,亞 G1期峰隨著藥物濃度的增加而逐漸明顯。

正常狀態(tài)下的 HL-60細胞大多數(shù)處于 G1期,S期次之,G2/M期最少。冬凌草甲素處理后使細胞周期發(fā)生變化:G1期、S期細胞的比例減少,G2/M期細胞的比例增加,且隨著藥物濃度的增加而逐漸明顯。結(jié)果表明,冬凌草甲素能夠誘導(dǎo) HL-60細胞發(fā)生凋亡,且隨著藥物濃度的增加而逐漸增加,見表 1。

表1 不同濃度的冬凌草甲素對 HL-60細胞的PI檢測

2.3 冬凌草甲素對 HL-60細胞 p53基因 mRNA表達的影響 RT-PCR結(jié)果顯示,與對照組相比,冬凌草甲素作用后,HL-60細胞 p53 mRNA水平顯著升高,且隨時間延長表現(xiàn)得更為明顯,見圖 3。

圖3 冬凌草甲素不同作用時間下HL-60細胞 p53mRNA的表達

3 討論

凋亡受抑是急性白血病(acute leukemia,AL)發(fā)生、發(fā)展及化療耐藥、治療失敗的主要原因。故誘導(dǎo)凋亡療法是消滅白血病細胞的一條新途徑。近年來中藥治療急性白血病有很大的進展,許多植物成分在體外有誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡的作用,但臨床應(yīng)用尚在研究中。

冬凌草甲素(rebescensine A)是從冬凌草中進一步提取出來的一種四環(huán)二萜類化合物。其活性成分及藥理作用機制比較復(fù)雜,總結(jié)文獻資料[4,5]其抗癌作用機制可能與以下因素有關(guān):①抗突變作用;②降低腫瘤細胞的鈉泵轉(zhuǎn)運活性;③增強其他抗腫瘤藥物的療效。既往研究資料顯示冬凌草甲素對急性白血病 HL-60細胞具有明顯的生長抑制作用,經(jīng)冬凌草甲素處理后的 HL-60細胞,其端粒酶活性下降,bcl-2表達水平下調(diào),部分細胞出現(xiàn)凋亡現(xiàn)象[3]。我們研究也證實了冬凌草甲素對 HL-60細胞的生長抑制作用,并且在 10～25μmol/L范圍內(nèi)的冬凌草甲素對 HL-60細胞生長抑制作用有濃度-時間依賴性。20μmol/L的冬凌草甲素處理細胞 48 h后,大部分細胞出現(xiàn)凋亡的形態(tài)學(xué)變化(見圖 1、圖 2)。在膜聯(lián)蛋白 V-FITC及 PI染色,流式細胞儀分析中發(fā)現(xiàn):在相同作用時間下,HL-60細胞凋亡率隨藥物作用劑量的增高而升高,并且在冬凌草甲素對 HL-60細胞周期影響的試驗中亦得到證實。

凋亡的過程受到多種因子調(diào)控,p53是其中一個重要調(diào)控因子,在維持細胞正常生長、抑制惡性增殖過程中起著重要作用。p53作為一個轉(zhuǎn)錄因子對DNA損傷做出反應(yīng),并誘導(dǎo)下游蛋白如 p21、Mdm2和 Bax的表達,這些下游蛋白可以調(diào)節(jié)細胞周期和凋亡。正常的 p53在細胞里的功能有多種,包括DNA結(jié)合功能、細胞循環(huán)過程的控制、DNA修復(fù)、細胞調(diào)亡控制、參與細胞分化和基因的可塑性調(diào)控[6]。但目前研究最多的有兩種,一種是抑制細胞分裂,讓其停留在細胞周期的 G1期,另一種是使細胞凋亡,此兩種功能與 p53轉(zhuǎn)錄的能力均有一定程度的聯(lián)系。

p53介導(dǎo)凋亡的機制可能是通過以下幾點:①在凋亡過程中線粒體膜失去完整性,接著細胞色素C釋放入胞漿,引起 caspase斷裂激活。抗凋亡蛋白Bcl-2和促凋亡蛋白 Bax可調(diào)節(jié)細胞色素 C釋放。Bax顯示在它的促進子內(nèi)有某些 p53結(jié)合位點,它對 DNA損傷的上調(diào)反應(yīng)并增加p53[7]。p53介導(dǎo)的細胞凋亡能被 Bcl-2/Bcl-x抑制。②活性氧 (ROS)是線粒體損傷和凋亡的有力的激活劑。許多蛋白能增加 ROS的產(chǎn)生,因此氧化應(yīng)激能被 p53誘導(dǎo)[8,9]。③Fas通過 FasL三聚化作用被激活繼而導(dǎo)致caspase激活。Fas過度表達能引起凋亡且被認為是p53依賴的,但是機制尚不清楚[10]。p53可以上調(diào)Fas并誘導(dǎo) Fas介導(dǎo)的死亡[11]。p53它通過停止細胞生長和誘導(dǎo)細胞凋亡而發(fā)揮其腫瘤抑制者的功能[12,13]。它是細胞生長的“監(jiān)控器”,是細胞生長重要的負調(diào)節(jié)蛋白,在細胞受到射線或某些藥物作用發(fā)生 DNA損傷的情況下,p53蛋白能阻止細胞周期停滯在 G1期,使細胞有足夠的時間修復(fù)損傷,恢復(fù)正常狀態(tài),重新進入細胞周期[14,15]。若損傷不能修復(fù),它可啟動細胞的程序性死亡過程引起細胞凋亡,從而保證有癌變傾向的細胞不再存活下去。在正常細胞里 p53的表達量很低,因此它不足以使細胞停止生長或死亡。然而當細胞受到某種損傷如 DNA損傷或缺氧后,p53的表達會急劇升高,從而使細胞停止在 G1期,使受損細胞修復(fù)或發(fā)生凋亡。wtp53是 G1期 DNA損傷的檢查點,充當“安全衛(wèi)士”監(jiān)視著細胞基因組的完整性[16]。滕理送等[17]用電穿孔法將正向攜帶野生型 p53基因 cDNA全長的反轉(zhuǎn)錄病毒重組質(zhì)粒(Dol p53)導(dǎo)入 p53基因突變的人腸癌細胞 SW1116,wtp53的表達使 SW1116細胞的G418抗藥性克隆形成減少,細胞生長速度較對照細胞明顯減慢,細胞增殖周期 G1期增加、S期下降。我們的實驗研究中冬凌草甲素處理后細胞周期發(fā)生的變化:G1期 S期細胞的比例減少,G2/M期細胞的比例增加,亦證實這一觀點。結(jié)果表明,冬凌草甲素能夠誘導(dǎo) HL-60細胞發(fā)生凋亡,且隨著藥物濃度的能夠誘導(dǎo) HL-60細胞發(fā)生凋亡,且隨著藥物濃度的增加而逐漸增加。

本實驗研究表明,冬凌草甲素作用后,HL-60細胞 p53mRNA水平顯著升高,且隨時間延長表現(xiàn)得更為明顯,本研究揭示,冬凌草甲素在誘導(dǎo) HL-60細胞凋亡的過程中伴有 p53基因上調(diào)和 G1期 S期細胞的比例減少,G2/M期細胞的比例增加,表明此基因參與冬凌草甲素誘導(dǎo) HL-60的細胞凋亡,并提示冬凌草甲素的凋亡誘導(dǎo)作用可能部分通過 p53途徑實現(xiàn)。同時也說明,冬凌草甲素可能是一種潛在的白血病治療藥物,這些資料為進一步進行臨床前的動物實驗以及冬凌草甲素廣泛應(yīng)用于臨床提供了更有力的理論及實驗依據(jù)。

[1] 吳孔明,張覃沐,王慶瑞,等.冬凌草甲素對腫瘤細胞鈉泵活性的影響[J].腫瘤防治研究,1994,21:208-209.

[2] 楊勝利,韓紹印,張巧,等.冬凌草甲素抗突變性研究[J].癌變·畸變·突變,2001,13(1):8-10.

[3] 申家英,楊 波.冬凌草甲素對HL-60細胞的生長抑制作用及其對細胞端粒酶活性的調(diào)節(jié)[J].白血病·淋巴瘤,2003,12(4):224-226.

[4] Suzuki A,Ito T,Kawano H,et al.Survivin initiates procaspase3/P21 complex fomation as a result of interaction with CDK 4 to resist Fasm idiated cell death[J].Oncogene,2000,19(10):1346-1353.

[5] Ikehara M,Oshita F,Kaneda Y,et al.Expression of survivin correlated with vessel invasion isamarker of poor prognosis in small adeno-carcinoma of the lung[J].Oncol Rep,2002,9(4):835-838.

[6] Hofseth LJ,Hussain SP,Harris CC.p53:25years after its discovery[J].Trends Pharmacol Sci,2004,25(4):177-181.

[7] Lotem J,Peled-KM,Groner Y,et al.Cellular oxidativestress and the control of apoptosis by wild-type p53 cytotoxiccompounds and cytokines[J].Proc Natl Acad Sci USA,2006(93):9166-9171.

[8] Johnson TM,Yu Z,Ferrans VJ,et al.Reactive oxygen speciesare downst ream mediators of p53 dependent apoptosis[J].Proc Natl Acad Sci USA,1999(15):11848-11852.

[9] Owen-shaub LB,Zhang W,Cusack JC,et al.W ild type human p53 and a temperat ure sensitivemutant induced Fas/Apo-1expression[J].Mol Cell Biol,2003(15):3032-3040.

[10] Evan G,Littlewood T.A matter of life and cell death[J].Science,2003,281(5381):1317-1322.

[11] King KL,Cidlowski JA.Cell cycle regulation and apoptosis[J].Annu Rev Physiol,1998(60):601-617.

[12] Ko LJ,Prives C.P53 puzzle and paradigm[J].Genes Dev,1996(10):1054-1072.

[13] Gottlieb TM,Oren M.P53 in growth control and neoplasia[J].Biochim Biophys Acta,2005(1287):77-102.

[14] El-Deiry WS,Tokino T,Velculescu VE,etal.WAFI,a potential mediator of p53 tumor suppression[J].Cell,2003(75):817-825.

[15] Zhang H,Hannon GJ,Beach D,et al.p21-containing cyclinkinases exist in bot h active and inactive states[J].Genes Dev,2004(8):1750-1758.

[16] Baror RL,Ruth M,Segel Lee A,et al.Generation of oscillations by the p53 Mdm2 feedback loop:a theoretical and experimental study[J].Proc Natl Acad Sci USA,2000,97:1125-1128.

[17] 滕理送,鄭樹,曹江,等.野生型 p53基因?qū)θ四c癌細胞的抑瘤效應(yīng)[J].中華實驗外科雜志,1997,14(3):146-147.

Effects of rebescensine A on HL-60 cell expression of p 53 and cell cycle changed

ZHAO Guoying1ZHAO Mingfeng2GUO Jinjiang1ZHANG Haihong1WANG Hui1
1 Department of Pediatrics Affiliated Hospital of Binzhou Medical University,Binzhou 256603;2 Departnent of Pathology,Affiliated Hospital of Binzhou Medical University

ObjectiveTo investigate the effects of rebescensine A on HL-60 cell expression of p53 and cell cycle.MethodsHL-60 cells in culturemedium in vitro were given different concentrations of rebescensine A.Propidium Idide(PI)binding and flow cytometry were used to detect cell cycle and apoptotic peak;And RT-PCR was used to observe the expression of p53.Resu ltsMarked morphological changes of cell apoptosis were observed.Cell cycle changed after the cells treated by rebescensine A:The ratio of G1and S-phase cells decreased,G2and M-phase cells increased and apoptotic cells count increased along with the increasing concentrations of rebescensine A.Theup-regulated of p 53mRNA were showed by RT-PCR and changed more obviously with prolongation in HL-60 cells treated by rebescensine A 20μmol/L.ConclusionRebescensine A could change the cell cycle ofHL-60 cells,and the up-regulated of p 53 gene,which induced apoptosis.

HL-60 cells,rebescensine A,cellcycle,p53

R562.2

A

1001-9510(2010)01-0012-04

2009-10-13)